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过氧化物酶(pod)测试方法
点击次数:2464 更新时间:2016-10-26
 

过氧化物酶(pod)测试原理:

过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反响,产品为醌类化合物,此化合物进一步缩合或与别的分子

缩合,发生颜色较深的化合物。本试验以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物酶的底物,在此

酶存鄙人,H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值,即可求出该酶的活性。

试验准备:

仪器:分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器

试剂:愈创木酚、30%H2O2、0.2mol/L磷酸缓冲液(7.8)、0.1mol/L磷酸缓冲溶液(PH6.0,见附录)

反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲溶液(PH6.0)50ml,参加愈创木酚28μl,于磁力搅拌器上加热搅

拌,直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后,参加(待溶液冷却后再参加,不然导致分解)30%H2O2

19μl,混合均匀,保留于冰箱中。

实践的构成和装备:

试剂一:液体60ml×4瓶,4℃保留6个月

试剂二:粉剂×3瓶,4℃保留6个月

试剂二使用液的装备:临用每瓶粉剂参加10ml的双蒸水溶解,4℃避光保留

试剂三:液体5ml1瓶,4℃保留6个月

  试剂三使用液的制造:临用前用双蒸水15倍稀释,使得1cm光径,双蒸水调零时A240保持在0.4摆布,现用现配。若A值太高,则加双蒸水稀释,若A值太低,则参加适量试剂三。(通常在25倍摆布稀释)

试剂四:液体50ml×2瓶,4℃保留6个月。

说明书:

(1)检查的成果没有吸光度值或吸光度值很低
  也许导致的原因有试剂盒已过有效期、运用的试剂盒内容物不是同一个批次的、没参加 酶符号物、试剂盒的内容物没有充沛的回温、孵育的温度太低一级,相对应的解 决办法是替换 成在有效期以内的试剂 盒、运用 同~个批次的试剂盒的内容物、依照试剂盒阐明书中的过程进行操作、将试剂盒的内容物充沛的回温后再进行操作、在试验操作的全部过程中请仔细观察恒温箱的温度。


(2)规范曲线的线性 欠好,或 平行性欠好(双孔对照孔的OD值 不一样很大),或呈现跳孔的景象
  也许导致的原因有酶标板孔间彼此污染、洗板后未能赶快进行下一 步操作、增加样品或其 它试剂时操作的办法不对、孵育方位避光性欠安或盖板膜没有密封好使得水分蒸发、酶标板孔问参加的试剂量不一样,相 对应的解决办法是加样时请当心勿将液体溅人另一孔中,人工洗板时也请当心,勿将洗涤液溅人另一微孔中、在洗板后及时进行下一步操作、增加试剂时请悬空滴入,牢记勿将枪头接触到板 孔内,汲取不一样试剂瓶中的液体时就要替换一次枪头 、 承认孵育环境不透光,盖板膜将酶标板 密封好、运用已校正过的微量加样器,如将次参加液体时枪头上留有一滴的液体滴下,那么将 今后枪头上留有的液体也滴下,以确保参加液体体积的一致性 。


(3)吸光度值偏
  高也许导致的原因有孵育的温度过高、反应 的时刻过长。相对应的解决办法是调整孵育环境的温度,如无法调整 室内的温度,请将显色时刻适当的缩短、操控反应时刻。

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(4)阴性样本的吸光度值低
  于阳性吸光度值也许导致的原因是呈现跳孔的景象或酶标板孔中的试剂未充沛的混合。解 决的办法是留意操作的办法,留意洗涤时的办法、加 完试剂后可将酶标板在桌子上平行悄悄晃动30s,混匀液体 。