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50742.1 v.A
细胞酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）活性光度法定量检测试剂盒
产品说明书
主要用途
细胞酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过酪氨酸羟化酶反应系统
中底物酪氨酸羟基化后，受到高碘酸氧化后，产生多巴色素，呈现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定
细胞裂解悬液样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于
各种人体和动物细胞裂解悬液样品中酪氨酸羟化酶的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即
用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase；TH；EC1.14.16.2），又称为酪氨酸3-单加氧酶（tyrosine 3-monooxygenase）
或L-酪氨酸四氢生物蝶呤：氧气氧化还原酶-3-羟基化（L-tyrosine tetrahydropterin：oxygen
oxidoreductase-3-hydroxylating），属于四聚体芳香族氨基酸羟化酶（tetrameric aromatic amino acid
hydroxylase）家族成员，为同源四聚体，由羧基末端四聚体化结构域、中央催化结构域和氨基末端调节结
构域组成，分布在中枢神经系统、周围交感神经元（synphathatic neurons）、肾上腺髓质（adrenal medulla）
等组织，催化L-酪氨酸（L-tyrosine）的羟基化反应，转化为L-3,4-二羟基苯基丙氨酸（L-3,4-dihydroxyphenyl
alanine），即多巴（L-dopa），并由分子氧、二价铁和四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin；BH4）作为辅因子
的参与，是神经传导介质多巴胺（dopamine）、去甲肾上腺素（norepinephrine 或noradrenaline）和肾上腺素
（epinephrine,或adrenaline）等生物合成的*步。酪氨酸羟化酶受到各种激酶，例如MAPKAPK2、ERK1、
ERK2 等磷酸化而活性短暂增强，激素、药物、cAMP、PKA、PKC 等促使酶活长期增强。酪氨酸羟化酶成
为慢性应激的标志。酪氨酸羟化酶异常，与阿茨汉姆症、巴金森氏症、Segawa 肌张力不全症（Segawa’s
dystonia）、亨丁顿舞蹈症（Huntington's disease）等有关。基于底物酪氨酸和辅因子二甲基四氢生物蝶呤
（6,7-dimethyl-5,6,7,8- tetrahydrobiopterin；DMTHP），在酪氨酸羟化酶的催化下，产生多巴，经高碘酸盐
的氧化，生成多巴色素，通过其吸光值的变化（475nm 波长），来定量测定酪氨酸羟化酶的活性。其反应系
统为：
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
底物液（Reagent D） 毫升
氧化液（Reagent E） 毫升
阴性液（Reagent F） 微升
产品说明书1 份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）、底物液（Reagent D）和氧化液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃
冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证6 月
用户自备
1.5 毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
微型台式离心机：用于样品制备
比色皿或96 孔板：用于光度测定的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光度分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。底物液（Reagent D）避免光照。然后进
行下列操作。
一、样品准备
1． 准备好25cm2 细胞培养瓶或60mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1 至5 X 106 细胞）
2． 小心加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx 毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5 分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx 微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10．转移到预冷的1.5 毫升离心管
11．强力涡旋震荡15 秒
12．置于冰槽里孵育30 分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心5 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管
15．移取10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1. 准备好上述待测样品，置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长475nm
3. 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、背景对照测定
1． 移取xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx 微升底物液（Reagent D）
3． 加入xx 微升阴性液（Reagent F）
4． 加入xx 微升氧化液（Reagent E）
5． 上下倾倒数次，混匀
6． 在37℃培养箱里孵育30 分钟
7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景读数
四、样品测定
1. 移取xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx 微升底物液（Reagent D）
3. 加入50 微升待测样品（注意：50 微克蛋白总量）
4. 加入xx 微升氧化液（Reagent E）
5. 上下倾倒数次，混匀
6. 在37℃培养箱里孵育30 分钟
7. 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数
五、计算样品活性
六、酶标仪测定
1． 在96 孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取xx 微升缓冲液（Reagent C）到所有孔里
3． 分别加入xx 微升底物液（Reagent D）
4． 分别加入xx 微升阴性液（Reagent E）或待测样品（50 微克蛋白总量）
5． 分别加入xx 微升氧化液（Reagent D）
6． 轻轻摇动96 孔板
7． 在37℃培养箱里孵育30 分钟
8． 即刻放进酶标仪检测，获得背景和样品读数
9． 活性计算
注意事项
1． 本产品为20 次（比色皿）和80 次（96 孔板）操作，包括背景对照
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1 次
4． 测定值由低到高变化；测定持续30 分钟
5． 光度测定后，比色皿须清洗*
6． 样本读数高于背景读数表明具有酶活性
7． 建议待测样本蛋白浓度为50 微克/50 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本
公司提供Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
8． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
9． 可以使用酪氨酸羟化酶抑制剂曲酸（3-iodo-tyrosine；3IT）作为抑制剂对照或阴性对照
10．酪氨酸羟化酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.0 条件下，每分钟内能够产生1 纳摩尔多巴所需的酶量
作为一个活性单位
11．本公司提供系列酪氨酸酶检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感