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HL50162.3.3 v.A

细胞IKKβ激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细胞IKKβ激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成多肽底物，在IKKβ激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下，受到IKKβ磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中IKKβ特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中IKKβ激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

B细胞κ轻链多肽基因促动子抑制剂激酶复合物（Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells，kinase complex；IκB kinase；IKK；EC 2.7.11.10），是NF-κB信号通路中的成员之一，由3个亚体构成：IKKα，又称为IKK1或CHUK（conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase）；IKKβ，又称为IKK2或IKBKB；IKKγ，又称为NEMO或IKBKG。ITI1、GPRK2L、GPRK4，属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属中鸟苷酸结合蛋白偶联受体激酶（guanine nucleotide-binding protein-coupled receptor kinase；GRK）亚系成员之一。多基因GRK亚系由6个成员构成，分成3类：包括GRK1（视网膜色素激酶家系；rhodopsin kinase）、GRK2/3（β肾上腺素能受体激酶；β-adrenergic receptor kinase）以及IKK/5/6（IKK激酶）。其中G蛋白偶联受体激酶4至少有4种变异体：IKKα、β、γ、δ，在睾丸组织中高度表达。IKK使G蛋白偶联受体，例如多巴胺等去敏化（desensitization）、以及精子授精等有关。其目标蛋白为活化的G-蛋白偶联受体蛋白，进行磷酸化后，抑制其功能。其功能异常将导致遗传性或获得性高血压等疾病。其磷酸化目标序列为RRREEEEESAAA。基于底物RRREEEEESAAA，在IKKβ激酶敏感性抑制剂5-苯基-3-脲啶噻吩-2-甲酰胺（(5-phenyl-3-ureido)-thiophene-2-carboxamide）存在与否的情况下，受到IKKβ激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析IKKβ的特异活性。其反应方式为：

产品内容

清理液（Reagent A）  毫升

裂解液（Reagent B）  毫升

缓冲液（Reagent C）  毫升

酶促液（Reagent D）  微升

反应液（Reagent E）  微升

底物液（Reagent F）  微升

阴性液（Reagent G）  微升

专性液（Reagent H）  微升

产品说明书       1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

IKKβ激酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于组织预处理

100微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤

• 待测样品准备

• 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
• 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反应液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入xx微升阴性液（Reagent G）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

• 样品总活性测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反应液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F）
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟 

• 样品非特异活性测定

检测开始前，移取xx微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反应液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 放进30℃培养箱里静置3分钟
• 加入20微升上述预处理的待测样品
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

• 计算样品活性

• 样品总活性和非特异活性计算

2）样品特异活性计算

七、酶标仪测定

1）样品总活性测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 分别加入xx微升反应液（Reagent E）
• 分别加入xx微升底物液（Reagent F）
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
• 活性计算：

• 样品非特异活性测定

检测开始前，移取xx微升缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

• 在96孔板上做好相应标记：待测样品
• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反应液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入20微升上述预处理的待测样品
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
• 活性计算：

• 样品特异活性计算

八、抑制剂筛选

• 在96孔板上做好相应标记：背景、*活性和待测抑制剂样品
• 按下表加入试剂，进行样品预处理

• 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 分别加入xx微升反应液（Reagent E）
• 分别加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 轻轻摇动96孔板
• 在30℃温度下孵育3分钟
• 加入20微升上述预处理的待测样品
• 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
• 抑制活性计算：

注意事项

• 本产品为25次操作，包括背景操作
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
• 样品须澄清，至关重要 
• 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
• 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
• 光度测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 可以使用IKKβ抑制剂作为抑制剂对照或阴性对照
• IKKβ活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感