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HL50116.1 v.A

细胞多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途

细胞多聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成底物ADP核糖对硝基苯酚，受到PARP-1的作用，释放出显色产物对硝基苯酚，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体等）多聚ADP核糖聚合酶-1的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

多聚ADP核糖聚合酶-1（Poly (ADP-ribose) Polymerase；PARP；EC 2.4.2.30）是一种锌依赖性核酶，广泛存在于真核细胞中。PARP家属由18个成员，其中6个已经被证实，包括PARP-1（占90％）、PARP-2、PARP-3、PARP-4（VPARP）、PARP-/5b（tankyrase）等。PARP蛋白由4个结构域构成：DNA结合、切离、自修饰（automodification）、催化等结构域。其功能在于特异性地识别DNA损伤产生的单链或双链DNA断裂，并与之结合而激活，催化将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）转化成烟酰胺（nicotinamide）和多聚ADP核糖分枝聚合体（branched polymers of various poly (ADP-ribose)）的反应，由此引导各种DNA修复蛋白聚集到损伤部位，实施修复，同时调节染色质结构形成（chromatin structure formation）、 细胞分化、繁殖、发育、凋亡、基因表达等，以及对于心脑缺血的反应和肿瘤恶变的作用。抑制PARP活性，可以防止心衰、中风、败血症等引起的组织损害。其中PARP-1由1014氨基酸残基组成，分子量113Kd，是细胞ATP/NAD细胞凋亡系统的主要调节因子。基于人工合成底物ADP核糖对硝基苯酚（ADP-ribose-p-nitrophenol），在损伤的DNA存在的前提下，受到多聚ADP核糖聚合酶-1的作用，释放出显色产物对硝基苯酚（p-nitrophenol），通过分光光度仪检测吸光读数的变化（405nm 波长），来定量分析多聚ADP核糖聚合酶-1的活性。其反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

缓冲液（Reagent C） 毫升

反应液（Reagent D） 微升

底物液（Reagent E）   微升

阴性液（Reagent F）   微升

产品说明书 1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

（微型）台式离心机：用于样品制备

比色皿或酶标板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

• 样品准备（总蛋白制备）

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长405nm，并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液（Reagent E）避免光照；缓冲液（Reagent C）室温下预热

• 背景对照测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反应液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 加入xx微升阴性液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育2小时
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景读数

• 样品测定

• 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升反应液（Reagent D）
• 加入xx微升底物液（Reagent E）
• 加入5微升待测样品（（20微克核蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白））（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育2小时
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数

五、计算样品活性

• 酶标板测定

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中
• 分别加入xx微升反应液（Reagent D）
• 分别加入xx微升底物液（Reagent E）
• 分别加入xx微升阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克核蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动酶标板
• 在25℃温度下孵育2小时
• 即刻放进酶标仪检测：获得背景读数和样品读数
• 活性计算：

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要 
• 用户可以选择使用核蛋白替代产品中的总蛋白制备
• 测定值由低到高变化；反应可持续2小时
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定2小时读数高于背景读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度：核蛋白为20微克/5微升；总蛋白为100微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 多聚ADP核糖聚合酶-1单位活性定义为：在25℃，pH 8.0条件下，每小时内能够释放1微摩尔对硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感