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组织沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂盒
点击次数：2101 更新时间：2017-01-17
 

HL50287.2 v.A

 

组织沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂盒

 

主要用途

 

组织沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过比色探针对硝基苯胺标记人工合成的乙酰化p53多肽底物，经过SIRT1脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放黄色对硝基苯胺，即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或*纯化酶样品中SIRT1的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

 

技术背景

 

人体组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家属分成三类共20多个蛋白：种类I（class I）与酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于细胞核中；种类II（class II）与酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化结构域含有锌，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。种类III（class III）为NAD+辅助因子必需，又称为sirtuins，与酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，为曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基团转化产生的烟酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于细胞核内，与酵母Sir2同源性高。其功能在于调节p53活性和抑制细胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53（379至382氨基酸位点）多肽底物Ac-Arg—His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切离的功能，首先使用比色染料对硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）来标记乙酰化p53多肽底物，其次进行脱乙酰化，后底物进一步在氨基肽酶的催化酶解，释放出具有强烈吸光值的黄色对硝基苯胺（波长405nm），由此来定量测定沉默调节蛋白1的活性。其反应系统为：

                               Sirtl

Ac-Arg-His-Lys-Lys(Ac)-p-NA+NAD → Ac-Arg-His-Lys-Lys-p-NA+nicotinamide+O-acetyl-ADP-ribose

                             氨基肽酶

        Ac-Arg-His-Lys-Lys-p-NA  → Ac-Arg-His-Lys-Lys+p-NA

产品内容

 

裂解液（Reagent A） 20毫升

分离液（Reagent B） 80毫升

清理液（Reagent C） 80毫升

萃取液（Reagent D） 5毫升

缓冲液（Reagent E）     3毫升

底物液（Reagent F）     100微升

终止液（Reagent G）     200微升

酶解液（Reagent H）     200微升

补充液（Reagent I）     500微升

产品说明书     1份

保存方式

 

保存缓冲液（Reagent E）、底物液（Reagent F）、终止液（Reagent G）和酶解液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证6月

 

用户自备

 

磷酸盐缓冲溶液（PBS）：用于清洗组织样品

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

（微型）台式离心机：用于组织细胞预处理

培养箱：用于反应物孵育

96孔板或100微升1厘米光径比色皿：用于反应和比色的容器

酶标仪或分光光度仪：用于比色分析

 

实验步骤

 

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

一、样品准备

 

  • 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 
  • （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
  • （选择步骤）加入3毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗1次
  • 移入到一个液氮冻存管
  • 即刻放进液氮罐过一晚
  • 次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
  • 放进一个15毫升锥形离心管
  • 加入1毫升裂解液（Reagent A），混匀组织样品
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管 
  • 强力涡旋震荡10秒
  • 置于冰槽里孵育15分钟
  • 加入4毫升预冷的分离液（Reagent B），混匀
  • 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入4毫升预冷的清理液（Reagent C）
  • 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
  • 小心抽去上清液
  • 小心加入100微升预冷的萃取液（Reagent D），混匀
  • 转移到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 超声处理30秒
  • 置于冰槽里孵育30分钟
  • 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
  • 小心移取上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
  • 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 准备好待测样品（例如核蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里
  • 设定好酶标仪或分光光度仪（温度为30℃）： 波长405nm，并置零 
  • 缓冲液（Reagent E）置于室温下均衡温度

 

三、活性测定

 

  • 终点法活性测定

 

  • 在96孔酶标板上做好相应标记：背景空对照和待测样品
  • 分别移取55微升缓冲液（Reagent E）到相应孔中
  • 分别加入5微升底物液（Reagent F）
  • 分别加入20微升补充液（Reagent I）或待测样品（50微克核蛋白或200微克组织裂解萃取液总蛋白）（注意：样品须清澈）
  • 轻轻摇动96孔酶标板30秒
  • 放进30℃培养箱里，孵育60分钟，避免光照
  • 分别加入10微升终止液（Reagent G）
  • 分别加入10微升酶解液（Reagent H）
  • 轻轻摇动96孔酶标板30秒
  • 在30℃培养箱里，孵育30分钟
  • 即刻放进酶标仪或转移到100微升1厘米光径比色皿，在分光光度仪里检测：获得吸光读数
  • 活性计算：

 

  • 酶标仪检测

 

【(样品读数-背景读数)×样品稀释倍数×0.10（体系容量;毫升）】÷【0.02（样品容量；毫升）×10.5（毫摩尔吸光系数）×1（反应时间；小时）×0.6（光径距离；厘米）】=单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升=单位/毫克

单位=微摩尔对硝基苯酚/小时

 

 

  • 比色皿检测

【（样品读数-背景读数）×样品稀释倍数×0.10（体系容量；毫升）】÷【0.020（样品容量；毫升）×10.5（毫摩尔吸光系数）×1（反应时间；小时）】=单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升=单位/毫克

单位=微摩尔对硝基苯酚/小时

 

 

  • 酶动法活性测定

 

  • 在96孔酶标板上做好相应标记：背景空对照和待测样品
  • 分别移取65微升缓冲液（Reagent E）到相应孔中
  • 分别加入5微升底物液（Reagent F）
  • 分别加入20微升补充液（Reagent I）或待测样品（50微克核蛋白或200微克组织裂解萃取液总蛋白）（注意：样品须清澈）
  • 轻轻摇动96孔酶标板30秒
  • 放进30℃培养箱里，孵育2分钟，避免光照
  • 分别加入10微升酶解液（Reagent H）
  • 轻轻摇动96孔酶标板5秒
  • 即刻放进酶标仪或转移到100微升1厘米光径比色皿，在分光光度仪里检测：间隔5分钟，读数6次（共30分钟）――获得吸光读数
  • 活性计算：

 

  • 酶标仪检测

【（样品读数-背景读数）×样品稀释倍数×0.10（体系容量；毫升）】÷【0.02（样品容量；毫升）×10.5（毫摩尔吸光系数）×30（反应时间；分钟）×0.6（光径距离；厘米）】=单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升=单位/毫克

单位=毫摩尔对硝基氨酚/分钟

 

  • 比色皿检测

【（样品读数-背景读数）×样品稀释倍数×0.10（体系容量；毫升）】÷【0.020（样品容量；毫升）×10.5（毫摩尔吸光系数）×30(反应时间；分钟】=单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升=单位/毫克

单位=微摩尔对硝基苯酚/分钟

  

注意事项

 

  • 本产品为20次操作，包括背景对照
  • 操作时，须戴手套
  • 系统操作过程中，背景测定只需1次
  • 样品须澄清，至关重要
  • 样品处理时，避免使用蛋白酶抑制剂、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等
  • 孵育反应完成后即刻进行比色测定
  • 滤波器可以使用波长400nm替代405nm
  • 测定值由低到高变化；酶动法测定可以持续60分钟
  • 测定值吸光读数越高，表明酶活性越高
  • 比色测定后，比色皿须清洗*
  • 待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为50微克/20微升；待测样本为组织裂解悬液，其蛋白浓度为200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）
  • 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
  • 沉默调节蛋白1单位活性定义为：在30℃，pH 8.0条件下，每分钟内能够释放1微摩尔对硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列组蛋白脱乙酰基酶检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感