精子顶体形态花生凝集素荧光标记（PNA-FITC）染色试剂盒产品说明书 主要用途 精子顶体形态花生凝集素荧光标记（PNA-FITC）染色试剂是一种旨在使用荧光素标记的花生凝集素和赫斯特33258双重荧光染色技术，分析生理性反应性或病理性退行性顶体缺失的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种动物或人体精子细胞以及冻存精子细胞，以及受精时的精子细胞。产品严格无菌，即到即用，操作简便，性能稳定，荧光清晰。 技术背景 在男科学（Andrology）中，精子（spermatozoa）分析提供了精子生成（spermatogenesis）、精子寿命、以及生育能力的基础信息。其中精子的活力（vitality）、运动能力（motility）、授精潜力（fertilizing potential）、膜结构或染色质结构完整性（integrity）、顶体反应（acrosomal reaction）功能的评价是精子分析的重要指标，也是决定人工受孕或体外授精（in vitro fertilization；IVF）的重要参数。其中顶体反应，是指当精子接近卵子实施授精时，精子头部前半端的帽状结构顶体，释放出溶解酶，以便精子和卵子的膜融合。顶体反应测试是一项稳定的精子功能参数，可以用于预测受精成功率。因此顶体的结构完整性（intact）是评价的主要标志，也是不育症和避免孕药物研究的对象。使用荧光素标记的花生凝集素（Isothiocyano-fluoresceinated peanut Arachis hypogaea agglutinin；PNA-FITC）和赫斯特33258（Hoechst 33258）双重荧光染色技术，是精子顶体反应分析和授精效率评价的常用的方法。首先使用赫斯特33258染色，分析精子活力，基于赫斯特33258具有有限的膜通透性特点，受到活体精子细胞（包括游动性和非游动性精子）的排斥，而容易进入死亡精子细胞。其次使用荧光素标记的花生凝集素染料，与顶体外膜糖蛋白上的半乳糖残基（β-D-galactosyl residue）的结合，显示完整性（未反应性unreacted）顶体，同时可以应用于受精时的精卵反应。双染的作用，以帮助区分生理性反应性顶体缺失（loss）或病理性退行性顶体缺失。通过常用的荧光显微镜（激发波长488nm，散发波长530nm）便可清晰观察到绿色顶体状态（status）。 产品内容 保存液（Reagent A） | 毫升 | 染色液A（Reagent B） | 毫升 | 清理液（Reagent C) | 毫升 | 固着液（Reagent D） | 毫升 | 染色液B（Reagent E） | 毫升 | 产品说明书 | 1份 |
保存方式 保存在－20℃冰箱里；染色液A和B（Reagent B和E）避免光照，有效保证6月 用户自备 碘化丙啶：用于精子细胞染色 1.5毫升离心管：用于样品操作的容器 微型台式离心机：用于样品染色操作的容器 血细胞计数器：用于细胞计数 载玻片和盖玻片：用于精子细胞爬片 （共聚焦）荧光显微镜：用于观察染色的精子细胞 细胞流式仪：用于分析染色的精子细胞 实验步骤 一、荧光显微镜分析 - 移取新鲜获得的1毫升精液（48小时内）到1.5毫升离心管
- 放进37培养箱孵育30分钟
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升保存液（Reagent A），混匀颗粒群
- 在血细胞计数器上进行精子细胞计数，并调整到2 × 107精子细胞/毫升
- 移取100微升精子细胞到新的1.5毫升离心管
- 加入xx微升染色液A（Reagent B），混匀
- 室温下孵育5分钟，避免光照
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升清理液（Reagent C），混匀颗粒群
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- 小心抽去上清液
- 重复实验步骤12至14一次
- 加入xx微升保存液（Reagent A），混匀颗粒群
- 即刻移取20微升到洁净的载玻片一端
- 用盖玻片或另一个载玻片推片
- 置于空气中凉干
- 加上xx微升预冷的固着液（Reagent D），覆盖样品表面
- 室温下孵育1分钟
- 小心抽去固着液
- 小心加上xx微升染色液B（Reagent E），覆盖样品表面
- 室温下孵育20分钟，避免光照
- 小心抽去染色液
- 小心加上xx微升清理液（Reagent C），覆盖样品表面
- 小心抽去清理液
- 盖上盖玻片或封片液
- 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下观察并计数（注意：每个视野计数200个精子）
观察蓝色荧光—染色液A（Reagent B）：滤波器激发波长350nm，散发波长460nm ――可见蓝色荧光，表明死亡精子细胞 观察绿色荧光—染色液B（Reagent E）：滤波器激发波长490nm，散发波长530nm ――可见绿色荧光，表明精子顶体区域 - 移取新鲜获得的1毫升精液（48小时内）到1.5毫升离心管
- 放进37培养箱孵育30分钟
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升保存液（Reagent A），混匀颗粒群
- 在血细胞计数器上进行精子细胞计数，并调整到2 × 107精子细胞/毫升
- 移取100微升精子细胞到新的1.5毫升离心管
- （选择步骤）加入xx微升染色液A（Reagent B），混匀
- （选择步骤）室温下孵育5分钟，避免光照
- （选择步骤）放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- （选择步骤）小心抽去上清液
- （选择步骤）加入xx微升清理液（Reagent C），混匀颗粒群
- （选择步骤）放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- （选择步骤）小心抽去上清液
- 加入xx微升染色液B（Reagent B），混匀颗粒群
- 室温下孵育20分钟，避免光照
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀颗粒群
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- 小心抽去上清液
- 加入200微升用户自备的碘化丙啶（propidium iodide；PI；0.4微克/毫升），混匀颗粒群
- 室温下孵育5分钟，避免光照
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀颗粒群
- 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为600g
- 小心抽去上清液
- 重复实验步骤26至28一次
- 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀颗粒群
- 即刻进行细胞流式仪分析：观察10000个细胞以上，200细胞/秒
激发波长 | 488nm | 488nm | 350nm | 染料 | 染色液B（Reagent E） | 用户自备的碘化丙啶（propidium iodide；PI） | 染色液A（Reagent B） | 匹配荧光染料 | 异硫氰酸荧光素（FITC） | 藻红蛋白（phycoerythrin；PE） | | 荧光颜色 | 绿色 | 红色 | 蓝色 | 散发波长 | 530nm | 630nm | 460nm | 流式仪通道 | FL2 | FL3 | FL1 | 荧光增强 | 精子顶体完整性 | 精子膜完整性 | 死亡精子细胞 |
- 三色标记细胞流式仪检测参考图像如下（X轴：FL2—绿色荧光；Y轴：FL3—红色荧光）
象限 | 荧光结果 | 结果分析 | 左下象限 | PI—PNA—HOUCHST— | 完整顶体和膜的活体精子细胞 | 左上象限 | PI+PNA—HOUCHST+ | 完整顶体而不完整膜的死亡精子细胞 | 右下象限 | PI—PNA+HOUCHST— | 顶体损坏而膜完整的活体精子细胞 | 右上象限 | PI+PNA+HOUCHST+ | 顶体损坏和不完整膜的死亡精子细胞 |
注意事项 - 本产品为20次操作
- 操作时须戴手套
- 样品检测前，建议在血细胞计数器上进行精子细胞计数
- 精子细胞计数时乘上稀释倍数104。标准血细胞计数器（Hemocytometer）的计算方法是：
1毫米方块的细胞计数X 104（稀释倍数）＝实际细胞数/毫升 - 染色完成后，即刻进行检测分析
- 用户可以使用钙离子载体A23187或Ionomycin诱导精子顶体缺失
- 用户可以使用SYBR-14替代HOUCHST33258，进行细胞流式仪分析
- 通常使用PSA-FITC和PI双染用于细胞流式仪分析
- 完整顶体（intact/whole acrosome）参考图像如下：
- 顶体赤道部分（Equatorial segment）参考图像如下：
质量标准 |
ELISA（酶免）试剂盒
人ELISA试剂盒
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