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大鼠呼肠孤病毒III型ELISA检测试剂盒
点击次数:1070 更新时间:2021-03-11
 

本试剂盒用于体外定性检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中大鼠呼肠孤病毒III型(Reo-3)。

有效期:6个月

保存条件:2-8℃

本试剂盒仅供科研使用,不得用于临床诊断

 

实验原理

试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被大鼠呼肠孤病毒III型(Reo-3)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、阴性和阳性对照、HRP标记的检测抗体,经过温育并*洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠呼肠孤病毒III型(Reo-3)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),判定阴阳性。

 

样本处理及要求

1.  血清:将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜,然后1000×g离心20 分钟,取上清即可,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

2.  血浆:用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本,并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

3.  组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟,取上清检测。

4.  细胞培养物上清或其它生物标本:请1000×g离心20分钟,取上清即可检测,或将上清置于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。

注:标本溶血会影响后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。

 

需要而未提供的试剂和器材

1.  酶标仪(450nm)

2.  高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.  37℃恒温箱

4.  蒸馏水或去离子水

 

试剂盒组成

 

名称 96孔配置 48孔配置 备注

微孔酶标板 96孔 48孔 无

阴性对照 0.3mL 0.3mL 无

阳性对照 0.3mL 0.3mL 无

样本稀释液 6mL 3mL 无

检测抗体-HRP 10mL 5mL 无

20×洗涤缓冲液 25mL 15mL 按说明书进行稀释

底物A 6mL 3mL 无

底物B 6mL 3mL 无

终止液 6mL 3mL 无

封板膜 2张 2张 无

说明书 1份 1份 无

自封袋 1个 1个 无

 

注意事项

1.  严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2.  洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3.  消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。

4.  底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。

5.  避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.  在储存和温育时避免强光直接照射。

7.  平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.  任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9.  不能使用过期产品。

10.  如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。

 

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

 

操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置阴性对照孔、阳性对照孔和样本孔,阴性、阳新对照孔各加50μL对照品;

3.  样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。

4.  除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

6.  每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

 

实验结果计算

1. 阴性对照OD值:小于0.2。

2. 阳性对照OD值:大于0.8。

3. 阳性判断(Cut-Off值):阴性对照OD值+0.15,样本OD值大于阈值,判定为阳性,反之,为阴性。