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主要用途

植物氢ATP酶（H^＋-ATPase）总活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用氢ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在排除其它ATP酶干扰的情况下，受到氢ATP酶的水解产生的ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等H^＋-ATP酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

氢ATP酶（H^＋-ATPase；EC3.6.3.6），又称为质子或氢离子转位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量传导过程中起着重要作用。其分成三类：质膜型（plasma membrane type或P型）、真细菌型（eubacterial type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）。质膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的质膜上，约100kd蛋白；真细菌型存在于叶绿体、线粒体和细菌上，由疏水的膜部分和亲水的催化部分组成；囊/液泡型存在于真核生物细胞器的囊泡系统。其中植物质膜氢ATP酶，100kd分子量，是植物细胞膜上重要的功能酶，为植物生命活动的主要酶之一。液泡型氢ATP酶是V型ATP酶的主要成员，400至600kd，含有胞浆复合体（V1）和胞膜复合体（V0），通过产生电子泵，转移质子，是微粒体和溶酶体酸性化，同时提供次级活性转运体的动力。氢ATP酶催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。这一去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。同时利用细胞内ATP释放的能量逆向跨质膜把质子转运出细胞，产生并保持细胞膜或细胞器两侧氢离子的电化学梯度，为一系列次级转运体和通道蛋白对各种营养物质及离子的跨质膜转运提供能量。植物氢ATP酶还参与细胞内pH水平、细胞伸长、气孔开闭、以及植物对环境的应激反应等多种生理过程的调节。基于底物ATP，在排除其它，包括钙（EGTA处理）、钠钾（乌本苷；ouabain处理）和氢钾（奥美拉唑；omeprazole）等ATP酶的干扰下，受到氢ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析氢ATP酶的特异活性。其反应系统为：

H^＋-ATPase

 ATP  +  H2O  →    ADP  +  Pi

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate +  ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

    （高吸收峰）    （低吸收峰）

产品内容

清理液（Reagent A）         60毫升

裂解液（Reagent B）             20毫升

缓冲液（Reagent C）         20毫升

酶促液（Reagent D）            500微升

反应液（Reagent E）            2.5毫升

底物液（Reagent F）          2.5毫升

阴性液（Reagent G）            1毫升

产品说明书                1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应孵育

比色皿：用于光谱分析的容器

分光光度仪：用于光谱分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；缓冲液（Reagent C）室温下预热。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好新鲜的植物组织（叶片、谷粒、种子等），并秤重以确定组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入适量的（1克组织需要3毫升）清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎组织

5． 放进一个预冷的15毫升锥形离心管

6． 加入预冷的1毫升裂解液（Reagent B）

7． 涡旋震荡5秒，充分混匀

8． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器，在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约80下）

9． 将所有组织匀浆物移入1.5毫升离心管，放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心移出上清液（注意：不要触碰沉淀物）到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管

11． （选择步骤）如果上清液含有肉眼可见的残渣，重复离心5分钟一次，速度为5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

12． 即刻移入到1.5毫升离心管

13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

14． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备

1． 准备好待测样品（例如植物组织裂解样品等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为28℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零

三、 背景对照测定

1． 移取730微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入100微升反应液（Reagent E）

4． 加入100微升底物液（Reagent F）

5． 放进28℃培养箱里静置3分钟

6． 加入50微升阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟

四、 样品活性测定

1． 移取730微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入100微升反应液（Reagent E）

4． 加入100微升底物液（Reagent F）

5． 放进28℃培养箱里静置3分钟

6． 加入50微升待测样品（注意：100微克总蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数30分钟

五、 计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10或30（反应时间，分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

或者

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.1（样品重量；毫克）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 10或 30（反应时间，分钟）]＝单位/毫克 

单位＝微摩尔NADH/分钟

 注意事项

1． 本产品为21次操作，包括背景对照测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

5． 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定

6． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟

7． 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数，表明有酶活性

8． 光谱测定后，比色皿须清洗*

9． 建议待测样本总蛋白浓度为100微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）

10． 样品特异活性是指排除其它，包括钙（EGTA处理）、钠钾（乌本苷；ouabain处理）、氢钾（奥美拉唑；omeprazole）等ATP酶的干扰后的氢ATP酶活性

11． 氢ATP酶活性单位浓度定义：在28℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

12． 本公司提供系列ATP酶类分析技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确