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主要用途

真菌/酵母细胞线粒体粗提分离试剂是一种旨在使用生物、化学和物理方法相结合，有效去除真菌/酵母菌细胞壁，进一步快速且充分裂解真菌/酵母菌细胞，从而分离出完整而纯化的线粒体细胞器的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种新鲜培养或冻存的野生型或突变型真菌/酵母菌菌株细胞的线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度堪称同类产品*佳。

技术背景

线粒体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的手段之一。从任何组织或细胞分离线粒体的技术方法基本上采用：第一，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的线粒体。 

产品内容

清理液（Reagent A）                      250毫升

平衡液（Reagent B）                   250毫升

酶解液（Reagent C）                   500微升

裂解液（Reagent D）                        40毫升

净化液（Reagent E）                    10毫升

强化液（Reagent F）                     5毫升

保存液（Reagent G）                   100毫升

产品说明书               1份

保存方式

保存酶解液（Reagent C）和净化液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，严格避免污染；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于线粒体初步制备物的存放

50毫升锥形离心管：用于细胞收集后离心或清洗

1.5毫升离心管：用于保存线粒体

4℃台式离心机：用于沉淀细胞

4℃台式高速离心机：用于分离细胞器成分

恒温水槽：用于孵育反应物

DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

实验步骤

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent E）冻融，然后移出1毫升净化液（Reagent E）到4毫升的裂解液（Reagent D）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

1． 准备好50毫升新鲜真菌/酵母菌样品

2． 在分光光度仪上测OD600＝1.0（1 OD＝1 X 10⁷细胞/毫升；总量为5 X 10⁸细胞） 

3． 转移到预冷的50毫升锥形离心管

4． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入25毫升清理液（Reagent A），混匀

7． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g

8． 小心抽去上清液

9． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀

10． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g

11． 小心抽去上清液

12． 加入2毫升平衡液（Reagent B），混匀

13． 加入50微升酶解液（Reagent C），混匀

14． 放进30℃恒温水槽孵育60分钟，期间每隔15分钟轻轻用手摇匀

15． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀

16． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g

17． 小心抽去上清液

18． 加入5毫升平衡液（Reagent B），混匀

19． 放进30℃恒温水槽孵育30分钟，继续实验步骤21

20． 同时将平衡液（Reagent B）置入冰槽里预冷30分钟（注意：以下步骤在4℃环境下进行）

21． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g

22． 小心抽去上清液

23． 加入5毫升预冷的平衡液（Reagent B），混匀

24． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为3000g

25． 小心抽去上清液

26． 加入5毫升含有裂解液（Reagent D）和净化液（Reagent E）的裂解工作液

27． 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群

28． 选择下列其中一种方法：

方法一：物理处理法

1． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器

2． 在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约20下）（注意：参见注意事项10）

3． 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管

4． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

5． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

6． 放进4℃台式高速离心机离心10分钟，速度为10000g

7． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

8． （选择步骤）加入3毫升预冷的保存液（Reagent G）

9． （选择步骤）放进4℃台式高速离心机再次离心5分钟，速度为10000g

10． （选择步骤）小心抽去上清液

11． 加入1毫升保存液（Reagent G），充分混匀

12． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

方法二：化学处理法

1． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次

2． 加入500微升预冷的强化液（Reagent F）

3． 涡旋震荡5秒，充分混匀

4． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项11）

5． 加入5毫升预冷的保存液（Reagent G），轻轻摇动试管混匀

6． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1500g

7． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞

8． 放进4℃台式高速离心机离心10分钟，速度为10000g

9． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物

10． （选择步骤）加入3毫升预冷的保存液（Reagent G）

11． （选择步骤）放进4℃台式高速离心机再次离心5分钟，速度为10000g

12． （选择步骤）小心抽去上清液

13． 加入1毫升保存液（Reagent G），充分混匀

14． 即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

注意事项

1． 本产品为10次操作（50毫升菌液：1克细胞湿重或5 X 10⁸细胞）

2． 其它实际操作的细胞量与试剂使用量按比例调整：例如10毫升菌液（OD600=1）：试剂用量是标准用量的五分之一

3． 操作时，须戴手套

4． 操作时，避免污染母液

5． 50毫升（OD600＝1）菌液湿重约1克

6． 细胞生长条件影响线粒体的质量：建议在有氧条件下富含葡萄糖的培养基培养

7． 实验步骤20以下的所有操作均须在4℃或以下状态下进行

8． 建议使用足够的细胞量

9． 建议严格控制操作时间

10． 通常匀化次数为20下（或细胞颗粒群消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同菌株的细胞会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数

11． 通常孵育5分钟达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同菌株的细胞会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数

12． 通常1克细胞湿重或5 X 10⁸细胞的线粒体含量为50微克线粒体蛋白，但不同菌株或培养条件会存在差异；建议使用纯化线粒体蛋白质浓度定量测定试剂盒（HL10059）测定线粒体蛋白浓度

13． 如果需要计量线粒体，稀释后数分钟内完成，否则线粒体将分解

14． 本产品所获得的线粒体纯度和产量尤为理想

15． 制备产物如果放在－70℃冰箱里储存备用，严格避免反复冻融

16． 如果需要获得95％以上纯度的线粒体，使用真菌/酵母细胞线粒体分离（高纯）试剂盒（HL10049.3）

17． 线粒体正常活性测定方法是： CITRATE SYNTHASE活性、氧化磷酸化、细胞色素吸收峰谱等

18． 线粒体内外膜完整性测定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE活性和荧光JC染色

19． 本公司提供线粒体套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、线粒体溶解等

20． 本公司提供系列真菌/酵母细胞线粒体试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定分离的线粒体内外膜完整

3． 本产品经鉴定分离的线粒体维持正常活性

4． 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶