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主要用途 乳酸脱氢酶（LDH）释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂是一种旨在通过酶联连续反应系统检测由于细胞损 伤导致的细胞内稳定的乳酸脱氢酶释放到细胞外，使四唑盐染料碘硝基氯化四氮唑（INT）还原为红色甲臜 （farmazan），即比色法定量测定酶活性，以评价活体细胞繁殖的而经典的技术方法。该技术经过精心 研制、成功实验证明的。适用于各种药物、化学、环境因子和营养因子处理的贴壁或悬浮生长中的动物或人 体细胞。替代传统的同位素[51 Cr]释放检测的。产品严格无菌，即到即用，简捷敏感，性能稳定， 显色清晰，检测准确，重复性好。

技术背景 细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的损害或*裂解导致细胞浆内的酶释放外泄到培养液里，其中包括活 性稳定的乳酸脱氢酶。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）释放法的测定是基于在乳酸脱氢酶的作用 下，还原NAD+反应生成的NADH，再与氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（Iodonitrotetrazolium； INT）在硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase）的催化下反应生成红色生色产物甲臜（formazan），在490nm波长下产 生吸收峰，从而确定释放的乳酸脱氢酶的活性，作为细胞膜完整性的标志：吸光值与细胞死亡或毒性程度成 线性正相关。酶联连续反应系统为：

产品内容 裂解液（Reagent A） 毫升 补充液（Reagent B） 毫升 反应液（Reagent C） 毫升 显色液（Reagent D） 毫升 终止液（Reagent E） 毫升 标准液（Reagent F） 微升（另购） 产品说明书 1 份

保存在－20℃冰箱里，反应液（Reagent C）和显色液（Reagent D）避免光照；有效保证 6 月

96 孔细胞培养板：用于细胞操作的容器 细胞培养箱：用于孵育反应 孔板离心机：用于沉淀细胞 酶标仪：用于定量检测染色后的细胞

1． 准备 96 孔细胞培养板的待测细胞（每孔 100 微升）：包括未处理的对照细胞（样品对照孔），未处理的 后续裂解的细胞（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞（处理样品孔），并做好标记（细胞密 度为每孔 2 X 103 至 2 X 104细胞） 

2． 到规定的检测时间点前 1 小时，从湿润的细胞培养箱里取出待测的 96 孔细胞培养板（注意：确保细胞培 养液维持在 100 微升容量） 3． 加入 xx 微升裂解液（Reagent A）到未处理的后续裂解的细胞孔里（样品最大酶活性对照孔） 

4． 同时加入 xx 微升补充液（Reagent B）到其余所有检测孔里 

5． 放回湿润的细胞培养箱里，继续培养 1 小时，即规定检测时间 

6． 从湿润的细胞培养箱里取出待测的 96 孔细胞培养板 

7． 放进孔板离心机离心 10 分钟，速度为 250g 

8． 分别小心移取 50 微升上清液到新的 96 孔板的相应孔里，避免触摸细胞颗粒，同时注意做好标记 

9． 分别加入 xx 微升反应液（Reagent C）（注意：使用前，须混匀） 

10．分别加入 xx 微升显色液（Reagent D） 

11．摇动 96 孔板混匀 

12．在室温下孵育 30 分钟，避免光照 

13．（选择步骤）分别加入 xx 微升终止液（Reagent E） 

14．即刻放进酶标仪里测读：波长 490nm 

15．计算处理样品实际吸光读数：处理样品孔吸光读数－样品对照孔吸光读数 

16．计算样品细胞最大酶活性的实际吸光读数：样品最大酶活性对照孔吸光读数－样品对照孔吸光读数 

17．计算细胞毒性或死亡率（％）： （处理样品实际吸光读数÷样品细胞最大酶活性的实际吸光读数）X 100 18．或绘制细胞生长曲线：纵座标（Y 轴）为实际吸光读数（A）；横坐标（X 轴）为细胞数或时间点或药物 浓度；据此计算其 LD50