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主要用途

动物细胞V型氢ATP酶（H^＋-ATPase）活性酶连续反应光度法定量检测试剂是一种旨在使用V型氢ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，在特异性抑制剂存在与否的情况下，受到V型氢ATP酶的水解产生的ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后吸光峰值（NADH浓度）的变化，以此进行测算单位酶活性的经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物细胞裂解悬液等V型H^＋-ATP酶的活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

氢ATP酶（H^＋-ATPase；EC3.6.3.6），又称为质子或氢离子转位ATP酶（Proton-Translocating ATPases），在生物能量传导过程中起着重要作用。其分成三类：质膜型（plasma membrane type或P型）、真细菌型（eubacterial type或F型）和囊/液泡型（vacuolar type或V型）。质膜型存在于植物、酵母和胃酸分泌型囊泡的质膜上，约100kd蛋白；真细菌型存在于叶绿体、线粒体和细菌上，由疏水的膜部分和亲水的催化部分组成；囊/液泡型存在于真核生物细胞器的囊泡系统。其中植物质膜氢ATP酶，100kd分子量，是植物细胞膜上重要的功能酶，为植物生命活动的主要酶之一。液泡型氢ATP酶（V type H^＋-ATPase）是V型ATP酶的主要成员，400至600kd，含有胞浆复合体（V1）和胞膜复合体（V0），通过产生电子泵，转移质子，是微粒体和溶酶体酸性化，同时提供次级活性转运体的动力。V型氢ATP酶催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。这一去磷酸化反应释放出能量，成为细胞生命代谢的能源。同时利用细胞内ATP释放的能量逆向跨质膜把质子转运出细胞，产生并保持细胞膜或细胞器两侧氢离子的电化学梯度，为一系列次级转运体和通道蛋白对各种营养物质及离子的跨质膜转运提供能量。动物V型氢ATP酶还参与细胞内以及细胞器（微粒体和溶酶体等）pH水平、液体分泌、跨膜电压等多种生理过程的调节。基于底物ATP，在V型氢ATP酶敏感性抑制剂巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）存在与否的情况下，受到V型氢ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的变化（340nm），来定量分析V型氢ATP酶的活性。其反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）            毫升

缓冲液（Reagent C）         毫升

酶促液（Reagent D）             毫升

反应液（Reagent E）             毫升

底物液（Reagent F）          毫升

阴性液（Reagent G）           毫升

专性液（Reagent H）              微升

产品说明书                1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度仪：用于光度分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光；缓冲液（Reagent C）室温下预热。然后进行下列操作。

一、 样品准备（总蛋白制备）

1． 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞 

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 BCA蛋白质浓度定量试剂盒－30031.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1． 准备好待测样品（例如动物细胞裂解样品等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔5分钟，读数7次（共30分钟），并置零

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反应液（Reagent E）

4． 加入xxx微升底物液（Reagent F）

5． 放进37℃培养箱里静置3分钟

6． 加入xx微升阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟或30分钟

四、 样品总活性测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放进37℃培养箱里静置3分钟

6． 加入50微升待测样品（注意：100微克总蛋白）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟或30分钟

五、 样品非特异活性测定

实验开始前，移取50微升待测样品（注意：100微克总蛋白）到1.5毫升离心管，加入xx微升专性液（Reagent H）（注意：使用前需融化），混匀后，放进37℃培养箱里孵育15分钟。然后置于冰槽里备用

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放进37℃培养箱里孵育3分钟

6． 加入60微升上述预处理的待测样品

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟或30分钟

五、 计算样品活性

1）样品活性（总活性和非特异活性）

2）样品特异活性

注意事项

1． 本产品为20次操作，包括背景对照测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钠盐、钾盐、镁盐、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

5． 建议使用动物细胞微粒体、囊泡样品；本公司提供的动物细胞膜性囊泡（RSOV和IOV）制备试剂盒（10169.1）

6． 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定

7． 反应测定值由高到低变化；测定可以持续30分钟

8． 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数，表明有酶活性

9． 光度测定后，比色皿须清洗*

10． 建议待测样本总蛋白浓度为100微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1）

11． 样品特异活性是指巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）敏感性V型氢ATP酶活性

12． V型氢ATP酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列ATP酶类分析技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确