体液糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒 | ||||||||||||||||||||||||
点击次数:1236 更新时间:2022-12-09 | ||||||||||||||||||||||||
19239.4 v.A
体液糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测 试剂盒产品说明书
主要用途
体液糖胺多糖(GAG)总含量二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法定量检测试剂是一种旨在通过高盐萃取可溶性糖胺多糖,与二甲基亚甲基蓝染料结合,在丙醇解离溶液中,释放紫红色染料,由分光光度仪比色分析,定量检测组织样品中糖胺多糖含量的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种人体或动物体液(例如脑脊液、关节滑液、尿液等),以及细胞培养液的糖胺多糖水平检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,检测准确。
技术背景
糖胺多糖(glycosaminoglycan;GAG),又称为粘多糖(mucopolysaccharide),是体内最为丰富的异源多聚糖。糖胺多糖是一种未分叉的负电荷性长链多聚糖,由重复的二糖单位,包括六碳糖(hexose)或己糖醛酸(hexuronic acid),链接到己糖胺(hexoamine)上而成。糖胺多糖与核心蛋白(core protein)共价相联,构成蛋白多糖(proteoglycan;PG),成为细胞膜和细胞外基质(extracellular matrix;ECM)的主要成分。蛋白多糖的糖胺多糖在合成过程中发生硫酸酯化(sulfated group),其部位在O或N位上,有利于发挥各种不同的作用,包括酶的调节、细胞黏附、生长、迁移、分化,以及组织损伤反应。基于糖胺多糖的高度负电荷的特点,使用异染性(metachromatic)阳离子蓝色染料二甲基亚甲基蓝(1,9-dimethylmethylene blue;DMMB),在酸性条件下,特异性的结合产生不溶性紫色或粉红色糖胺多糖染料复合物(Dye-GAG complex),在丙醇解离溶液中,释放出染料,通过分光光度仪(656nm波长)测定,来定量分析糖胺多糖的总含量。
产品内容
清理液(Reagent A) 1毫升 萃取液(Reagent B) 1毫升 染色液(Reagent C) 25毫升 解离液(Reagent D) 25毫升 标准液(Reagent E) 100微升 产品说明书 1份
保存方式
保存萃取液(Reagent B)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;染色液(Reagent C)避免光照;有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品操作的容器 15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器 恒温水槽或干式恒温仪:用于样品反应 微型台式离心机:用于样品操作 比色皿或96孔板:用于比色分析的容器 分光光度仪或酶标仪:用于比色分析
实验步骤
一、样品预处理
1. 准备好1.5毫升离心管 2. 移取1毫升液体(尿液/脑脊液/唾液/精液/关节液/培养液样品)到离心管 3. 放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为700g(或3000RPM,例如eppendorf 5415) 4. 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升离心管 5. 加入50微升萃取液(Reagent B) 6. 强力涡旋震荡1分钟,充分混匀 7. 放进56℃恒温水槽孵育16小时 8. 放进90℃恒温水槽孵育10分钟 9. 放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415) 10. 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管 11. 置于冰槽里备用
二、标准样品配制
1. 准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管 2. 分别加入50微升清理液(Reagent A)到1至5号管 3. 移取50微升标准液(Reagent E)到1号管,混匀 4. 小心移取50微升1号管稀释的标准液(Reagent E)到2号管,混匀 5. 小心移取50微升2号管稀释的标准液(Reagent E)到3号管,混匀 6. 小心移取50微升3号管稀释的标准液(Reagent E)到4号管,混匀 7. 将1至5号管放进冰槽里备用;标准管浓度见下表
三、 标准曲线测定
1. 移取50微升上述配制的标准液(Reagent E)到1.5毫升离心管 2. 加入1毫升染色液(Reagent C) 3. 涡旋震荡15秒 4. 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒 5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g 6. 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)(注意:可见紫色或粉红色沉淀) 7. 加入1毫升解离液(Reagent D) 8. 涡旋震荡15秒 9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解) 10. 转移到新的比色皿 11. 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得标准样品吸光读数 12. 重复实验步骤1至11四次 13. 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光读数;横座标(X轴)为标准糖胺多糖含量(微克)
四、 样品测定
1. 加入50微升上述制备的待测样品到1.5毫升离心管 2. 加入1毫升染色液(Reagent C) 3. 涡旋震荡15秒 4. 室温下孵育30分钟,避免光照,期间每隔5分钟涡旋震荡15秒 5. 即刻放进微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g 6. 小心抽去上清液(注意:确保没有水滴残留)(注意:可见紫色或粉红色沉淀) 7. 加入1毫升解离液(Reagent D) 8. 涡旋震荡15秒 9. 室温下孵育5分钟,避免光照(注意:确保充分溶解) 10. 转移到新的比色皿 11. 即刻放进分光光度仪检测(波长656nm):获得样品吸光读数 12. 根据上述标准曲线获得样品对应糖胺多糖含量(微克)
五、 浓度计算
根据上述标准曲线样品对应糖胺多糖含量(微克)÷0.050(样品容量;毫升)=微克糖胺多糖/毫升
注意事项
1. 本产品为25次操作,包括标准样品 2. 本产品不适合于非硫酸酯化的二糖降解片段、透明质酸(hyaluronate)的检测 3. 本产品可以检测硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、硫酸角质素(keratan sulfate)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、硫酸类肝素(heparan sulfate)等主要糖胺多糖 4. 本产品检测范围为0.2至5微克糖胺多糖 5. 操作时,须戴手套 6. 系统操作时,标准样品测定只需1次 7. 空白对照读数通常小于0.06,如果超过表明抽去上清操作不当 8. 孵育时,避免光照 9. 如果样品糖胺多糖含量过低,可以浓缩样品或增加样品量至100微升 10. 样品浓度可以表述为:微克糖胺多糖/总蛋白等 11. 本公司提供系列糖类代谢检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定 2. 本产品经鉴定检测敏感
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