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ATP酶法冰冻切片人体肌肉组织分型染色试剂盒产品说明书

主要用途

 ATP酶法冰冻切片人体肌肉组织分型染色试剂是一种旨在使用钙激活技术，在碱性或酸性条件下，由三磷酸腺苷酶催化水解产生的磷酸与钙离子结合，经过氯化钴的替换，最后在硫化铵存在的情况下，呈现组织样本中酶活性部位的不同深浅棕色沉淀现象的而经典的技术方法。该技术经过精心改良、成功实验证明的。主要适用于人体组织冰冻切片的酶活性检测，即人体肌肉组织纤维的分型鉴定。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，灵敏牢固，显色清晰。

技术背景

三磷酸腺苷酶或ATP酶（adenosinetriphosphatase；ATPase）可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，这一反应放出大量能量，用于运送离子进出细胞，同时供给生物体进行需能生命过程。它存在于生物细胞的多个部位，比如肌质网/内质网质膜上，对整个生命的维持有着重要的作用。其中骨骼肌受到神经冲动的刺激，肌浆内钙离子浓度升高，肌质网/内质网钙泵ATP酶（sarcoplasmic or endoplasmic reticulum calcium ATPases；SERCA）激活，分解ATP释放能量，肌肉收缩。人类肌肉由两种纤维构成，即I型或红肌，又称为慢纤维（slow twitch），和II型或白肌，又称为（fast twitch）。I型和II型肌纤维混合镶嵌排列成“棋盘样（checkerboard）"结构。在身体里，I型和II型纤维的比例取决于肌肉在机体中的位置和它的功能，相较于II型肌，I型肌的肌球蛋白含量高，线粒体多，毛细血管密度高，糖原低，适合于有氧呼吸，持久收缩。一般的肌肉，其纤维分布是II型纤维（60至65%）2倍于I型纤维。通过ATP酶染色，可以显示两型肌纤维，辅助诊断神经源性肌、脊髓性肌肉等。三磷酸腺苷酶（ATP酶）水解三磷酸腺苷为二磷酸腺苷和磷酸，并释放出能量。磷酸与钙离子结合，在酶活性处形成无色的磷酸钙，磷酸钙经氯化钴处理形成磷酸钴，再经硫化铵处理形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位。

产品内容

碱性液（Reagent A）                    15毫升

酸性液（Reagent B）                     5毫升

反应液（Reagent C）                     1毫升

激活液（Reagent D）                    30毫升

置换液（Reagent E）                    20毫升

清理液（Reagent F）                   250毫升

显色液（Reagent G）                    10毫升

产品说明书                1份

保存方式

保存反应液（Reagent C）和显色液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免反复冻融，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

苏木素复染试剂盒（HL80067）：用于选择性染色后复染

2毫升离心管：用于工作液配制的容器

培养箱：用于反应孵育

小型染色缸：用于染色清洗操作

光学显微镜：用于染色后观察分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent C）置入冰槽里融化，然后移出200微升到2毫升离心管里，加入1.8毫升碱性液（Reagent A），混匀后，标记为反应工作液，置于冰槽里备用（注意：5次操作量）。然后进行下列操作。

一、 样本激活处理

1． 取出2片待测的5至10微米厚的冰冻组织切片，标记为1和2（注意：参见注意事项3和4）

2． 小心加上200微升碱性液（Reagent A）在1号切片上，铺满整个样品表面（注意：滴液前，用手芯焐热试剂至室温）

3． 室温下孵育2分钟

4． 同时小心加上200微升酸性液（Reagent B）在2号切片上，铺满整个样品表面

5． 室温下孵育2分钟

6． 小心移去2号切片上的酸性液（Reagent B）（注意：滴液前，用手芯焐热试剂至室温）

7． 室温下，小心将2号切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育1分钟,，期间轻轻搅拌

8． 小心移去1号切片上的碱性液（Reagent A）和2号切片上的清理液（Reagent F）

9． 分别加上200微升反应工作液，铺满整个样品表面（注意：滴液前，用手芯焐热试剂至室温）

10． 放进37℃培养箱里，孵育30分钟（注意：如果染色较浅，建议延长时间至60分钟）

11． 小心移去反应工作液

12． 小心加上200微升激活液（Reagent D），铺满整个样品表面

13． 室温下孵育3分钟

14． 小心移去 激活液（Reagent D）

15． 重复实验步骤12至14二次

二、样本染色处理

1． 小心加上200微升置换液（Reagent E），铺满整个样品表面

2． 室温下孵育3分钟

3． 小心移去置换液（Reagent E）

4． 室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育2分钟,，期间轻轻搅拌（注意：如果染色出现杂质，建议使用无离子水冲洗）

5． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

6． 重复实验步骤4和5一次（注意：清洗不干净，可见棕黑色残渣颗粒）

7． 小心加上200微升显色液（Reagent G），铺满整个样品表面

8． 室温下孵育2分钟；或持续孵育直至可见浅棕和深棕色为止（注意：如果染色较浅，建议置于37℃孵育，避免干枯）

9． 小心移去显色液（Reagent G）

10． 室温下，小心将切片置入50毫升清理液（Reagent F）中孵育2分钟

11． 小心移去切片上的清理液（Reagent F）

三、 （选择步骤）样本复染处理

1． （选择步骤）样本复染处理（苏木素）

2． 放上盖玻片或封片

3． 即刻在一般光学显微镜下观察

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 操作时，须带手套

3． 建议使用异戊烷（isopentane）快速冷冻组织，避免切片冰晶形成

4． 冰冻切片不宜固定和包埋处理；避免干片

5． 试剂溶液在样品表面时，避免有气泡存在，同时确保铺满样品表面

6． 组织细胞染色注意不要过度

7． 可以使用有机溶剂（乙醇、二甲苯等）脱水、透明处理后封片 

8． 组织细胞染色完成后，即刻进行光学显微镜观察，否则会逐渐褪色 

9． ATP酶染色参考图像：

1）1号切片 

2）2号切

10． 本公司提供系列特定组织染色试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定显色清晰