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染色体核型吉姆莎（Giemsa）染色分析试剂盒产品说明书

主要用途

染色体核型吉姆莎（Giemsa）染色分析试剂是一种旨在通过使用吉姆莎染料与染色体DNA的结合并呈现深浅不一的条带，来显示染色体带型特征而构成细胞染色体核型的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于各种生长中的动物或人体细胞。产品即到即用，性能稳定，显色清晰。

技术背景

染色体核型（karyotyping）是一种根据体细胞中全套染色体带型形态特征和大小顺序排列，并依次配对、分组，构成该个体的核型或染色体组型的方法，从而可以识别和分析染色体结构和数量的异常，成为产前诊断或肿瘤细胞遗传学的工具。其中使用吉姆莎（Giemsa）染色，即经过胰蛋白酶处理后，进行吉姆莎染料染色，呈现系列深浅不一的300至400个条带，称之为G-带。其中浅色条带为异染色质、复制晚期以及AT丰富的区域，而深色条带为常染色质（euchromatic）、复制早期和GC丰富的区域。

产品内容

清理液（Reagent A）                 200毫升

滞态液（Reagent B）               1毫升

低渗液（Reagent C）             100毫升

固定液A（Reagent D）            375毫升

固定液B（Reagent E）            125毫升

消化液（Reagent F）              50毫升

中和液（Reagent G）              20毫升

预备液（Reagent H）              50毫升

染色液（Reagent I）              20毫升

产品说明书                           1份

保存方式

保存滞态液（Reagent B）、消化液（Reagent F）和中和液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；滞态液（Reagent B）和染色液（Reagent I），避免光照，有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于细胞脱离

细胞培养液：用于细胞培养

无离子水：用于清洗染色的载玻片

50毫升锥形离心管：用于细胞处理的容器

恒温水槽：用于预热试剂溶液

台式离心机：用于沉淀细胞

小型染色缸：用于载玻片染色的容器

载玻片：用于细胞涂片和染色

显微镜：用于观察细胞分裂和染色体组型

实验步骤

实验开始前，将试剂盒里的固定液A（Reagent D）和B（Reagent E）从4℃的冰箱里取出，移取A液37.5毫升和B液12.5毫升加入到50毫升锥形离心管，混匀后标记成为固定工作液，置入冰槽里。同时在37℃恒温水槽里预热清理液（Reagent A）、滞态液（Reagent B）、低渗液（Reagent C）。然后进行下列操作。

一、 限定细胞在有丝分裂中期（METAPHASE）

1）贴壁细胞处理

1． 抽去铺满生长细胞的75cm²细胞培养瓶的培养液

2． 加入10毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，

3． 小心抽去清理液（Reagent A）

4． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面

5． 放进37℃培养箱孵育3分种

6． 手击振动培养瓶，使细胞脱落

7． 加入15毫升用户自备的细胞培养液，充分混匀

8． 移出10毫升混匀物到新的75cm²细胞培养瓶

9． 加入10毫升用户自备的细胞培养液到上述新的75cm²细胞培养瓶

10． 放进37℃细胞培养箱孵育16至20小时

11． 小心抽去铺满70％生长细胞的75cm²细胞培养瓶的培养液

12． 加入10毫升用户自备的细胞培养液

13． 加入100微升37℃预热的滞态液（Reagent B），轻轻摇动细胞培养瓶，使其混匀

14． 放进37℃细胞培养箱，孵育2小时（注意：可以延长至12小时）

15． 在显微镜观察下，细胞开始收缩变圆，表明细胞处于有丝分裂

16． 手击振动拍打培养瓶，使细胞脱落

17． 移出含有滞态液（Reagent B）的细胞培养液到50毫升锥形离心管

18． 加入10毫升清理液（Reagent A）到培养瓶，清洗整个细胞表面

19． 移出清理液合并到50毫升锥形离心管

20． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面

21． 置入37℃培养箱3分种

22． 手击振动培养瓶，使细胞脱落

23． 加入10毫升用户自备的细胞培养液，充分混匀

24． 移出混匀物合并到50毫升锥形离心管

25． 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g

26． 小心抽去上清液（保留0.3毫升）

27． 手指轻弹混匀细胞

2）悬浮细胞处理

1． 准备好10⁸悬浮细胞（淋巴细胞、白细胞、骨髓细胞等）

2． 移入到50毫升锥形离心管

3． 放进台式离心机离心5分钟， 速度为300g

4． 小心抽去上清液

5． （选择步骤）加入10毫升 清理液（Reagent A），混匀颗粒群

6． （选择步骤）放进台式离心机离心5分钟， 速度为300g

7． （选择步骤）小心抽去清理液（Reagent A）

8． 加入15毫升用户自备的RPMI 1640细胞培养液，充分混匀细胞颗粒群

9． 转移到到新的75cm²细胞培养瓶

10． 放进37℃细胞培养箱孵育16至20小时

11． 移入到50毫升锥形离心管

12． 放进台式离心机离心5分钟， 速度为300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入10毫升用户自备的RPMI 1640细胞培养液，混匀细胞颗粒群

15． 加入100微升37℃预热的滞态液（Reagent B），混匀

16． 放进37℃细胞培养箱，孵育2小时（注意：可以延长至12小时）

17． 在显微镜观察下，细胞开始收缩，表明细胞处于有丝分裂

18． 放进台式离心机离心5分钟， 速度为300g

19． 小心抽去上清液

20． 加入10毫升用户自备的RPMI 1640细胞培养液，充分混匀

21． 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g

22． 小心抽去上清液（保留0.3毫升）

23． 手指轻弹混匀细胞

二．低渗处理有丝分裂细胞

1． 用滴管一滴一滴加入10毫升37℃预热的低渗液（Reagent C）到50毫升锥形离心管，轻轻摇动

2． 放进37℃细胞培养箱孵育15分钟

3． 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g

4． 小心抽去上清液（保留0.3毫升）

5． 手指轻弹混匀细胞

三．固定细胞

1．用滴管一滴一滴加入10毫升预冷的固定工作液到50毫升锥形离心管，轻轻摇动

2．放进冰槽里孵育至少5分钟

3．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g

4．小心抽去上清液（保留0.3毫升）

5．手指轻弹混匀细胞

6．重复上述步骤1至5，直到沉淀细胞颗粒群为白色（越白越好）

7．加入5毫升固定工作液到50毫升锥形离心管，充分混匀

四．染色体载片制作

1． 先将载玻片置于冰箱里冷却，然后放在实验台上，并排放上5至10张

2． 从高达30至60厘米处向下滴上3滴细胞混匀液在载玻片上，立即吹散开，使其散开或然后拿起载玻片，轻轻拍击手掌（注意：参见注意事项8）

3． 在显微镜下观察有丝分裂中期的细胞

4． 空气中晾干载玻片（注意：参见注意事项8）

5． 可以保存在70％酒精里，放进4℃冰箱长达一年。剩下的在固定液里的细胞可以长期保存在－20℃冰箱里

五．染色

1． 将晾干载玻片放进60℃恒温培养箱孵育过夜

2． 移出载玻片，室温下均衡温度

3． 加上50毫升37℃预热的消化液（Reagent F）到小型染色缸（Coplin jar）

4． 放进载玻片孵育10秒

5． 取出载玻片，加上200微升37℃预热的中和液（Reagent G），覆盖整个细胞表面

6． 小心移去中和液（Reagent G）

7． 放进含有50毫升预备液（Reagent H）的小型染色缸孵育30秒

8． 取出载玻片，加上200微升染色液（Reagent I），铺满整个细胞表面

9． 室温下孵育10分钟，避免光照

10． 取出载玻片，用用户自备的无离子水轻轻冲洗，直至不再褪色

11． 空气中晾干

12． 封片（有机溶剂型，例如DPX或PERMOUNT等）

13． 在一般光学显微镜下，观察呈现深浅不一的细胞染色体

注意事项

1． 本产品为10次（100载玻片）的操作量

2． 操作时，须戴手套

3． 细胞培养可使用25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿

4． 滞态液（Reagent B）为100倍浓缩

5． 使用滞态液（Reagent B）须注意操作安全，小心谨慎，如果溅于皮肤上，立即用水冲洗，并就医处理 

6． 使用低渗液（Reagent C）处理细胞，切莫超过30分钟时间，否则将导致细胞破裂

7． 使用固定液（Reagent D 和 F）处理细胞，可以在4℃冰箱里长达30分钟，甚至过夜 

8． 载玻片必须非常洁净，且要冷冻后使用

9． 建议从高处滴落样品，可以使细胞染色体舒展开来，便于观察

10． 上样后的载玻片可以放进37℃培养箱里烘干

11． 除了吉姆莎染色外，还有许多其它染色，例如，DAPI荧光染色，醋酸地衣红染色（aceto- orcein），福尔根染色（feulgen）、嗜碱性染色（basophilic dye）包括甲苯胺蓝染色（toluidine blue）或亚甲基蓝染色（methylene blue），喹吖因氮芥染色（quinacrine mustard；Q带），丫啶橙染色（acridine orange；R带）等

12． 吉姆莎染色人体染色体核型参考图像如下