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主要用途

组织长链酮脂酰辅酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用酮脂酰辅酶A作为底物，在镁离子和辅酶A的激活下，底物解离后峰值的降低，即采用比色法来测定组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）长链酮脂酰辅酶A硫解酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

脂肪酸β氧化过程（β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β-氧化及最后经三羧酸循环被氧化生成CO2和H2O，并释放能量等四个阶段。硫解酶（Thiolase）存在于真核和原核生物的细胞里，分成两种类型：一种为酮脂酰辅酶A硫解酶（3-ketoacyl-CoA thiolase；EC: 2.3.1.16），另一种为乙酰乙酰辅酶A硫解酶（acetoacetyl-CoA thiolase；EC: 2.3.1.9）。酮脂酰辅酶A硫解酶又称为硫解酶I（thiolase I），以各种链长脂肪酸为底物，催化脂肪酸β-氧化的最终反应，释放乙酰辅酶A，同时产生短缺2个碳基的脂酰辅酶A。在真核生物中，酮脂酰辅酶A硫解酶又分为线粒体型和过氧化酶体型。长链酮脂酰辅酶A（例如酮十六脂酰辅酶A；3-ketohexadecanoyl-CoA）在长链硫解酶I的催化下，发生镁-烯醇化物（Mg-enolate）的裂解，致长链酮脂酰辅酶A底物的减少，在分光光度仪（303nm）下，吸光值降低，来定量分析长链酮脂酰辅酶A硫解酶的活性。长链酮脂酰辅酶A硫解酶反应系统为：

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

一、样品准备

1．手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量 

2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3．（选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗

4．（选择步骤）抽去清理液

5．移入到一个液氮冻存管

6．即刻放进液氮罐过夜

7．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

8．放进一个15毫升锥形离心管

9．加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B） 

10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11．放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12．即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g 

13．小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管

14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

15．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备

1．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长303nm，间隔30秒，读数5次（共3分钟），并置零 

2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化 

3．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定

1．移取800微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入50微升反应液（Reagent D）

3．加入100微升底物液（Reagent E）

4．上下倾倒数次，混匀

5．在25℃温度下孵育3分钟

6．加入50微升阴性液（Reagent F）

7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－3分钟读数）

四、样品测定

1．移取800微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入50微升反应液（Reagent D）

3．加入100微升底物液（Reagent E）

4．上下倾倒数次，混匀

5．在25℃温度下孵育3分钟

6．加入50微升待测样品（10微克蛋白总量）（注意：样品须清澈）

7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－3分钟读数） 

五、计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X 13.5（毫摩尔吸光系数）X 3（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔酮脂酰辅酶A /分钟

六、酶标仪测定

1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2．分别移取200微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里

3．分别加入12.5微升反应液（Reagent D）

4．分别加入25微升底物液（Reagent E）

5．轻轻摇动96孔板

6．在25℃温度下孵育3分钟

7．分别加入12.5微升阴性液（Reagent F）或待测样品（10微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）

8．轻轻摇动96孔板

9．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和3分钟读数

10．活性计算：

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.0125（样品容量；毫升）X 13.5（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 3（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔酮脂酰辅酶A/分钟