技术文章Article 首 页 > 技术文章 > DNase I 溶液说明书
DNase I 溶液说明书
点击次数：687 更新时间：2023-04-14
 

产品简介：

DNase I ，   即 Deoxyribonuclease I ，   即脱氧核糖核酸酶 I ， 是一种可以消化单链或双链 DNA 产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I 水解单链或双 链 DNA 后的产物， 5'端为磷酸基团，3'端为羟基。

DNase I 活性依赖于钙离子，   并能被镁离子或二价锰离子激活 。镁离子存在条件下， DNase I 可随机剪切双链 DNA 的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I  可在同一位点 剪切 DNA 双链，形成平末端， 或 1 -2 个核苷酸突出的粘末端。

特点：不含 RNase (RNase free)， 可以用于各种 RNA 样品的处理 。提供了用于 DNase I 失活所需的 EDTA。

用途：制备不含 DNA 的 RNA 样品；RT -PCR 反应前 RNA 样品中去除基因组 DNA 等可 能的 DNA 污染；体外 T7, T3, SP6 等 RNA Polymerases 催化的 RNA 转录后去除 DNA 模板； DNase I footprinting 研究 DNA -蛋白质相互作用； 缺口平移(nicktranslatioin)；  产生 DNA 随 机片段文库； 细胞凋亡 TUNEL 检测中部分剪切基因组 DNA 作为阳性对照。

来源：从牛胰腺纯化得到 。分子量： 约  32kDa(单体)。

活性定义：37°C 10 分钟内，将能够降解 1 μg pBR322 质粒 DNA 所需的酶量定义为 1 个活性单位。

活性检测条件：40mM Tris -HCl (pH8.0) ， 10mM MgSO4， 1mM CaCl2 ， 1 μg of pBR322 DNA 。纯度：不含其它 DNA 内切酶和外切酶，不含 RNA 酶。

保存条件：

-20°C 保存， 一年内有效。

操作流程：

1 RT -PCR 反应前 RNA 样品中 DNA 的去除：

1.1 DNA 模板限制性核酸内切酶作用后线性化。酚/氯仿和氯仿/异丙醇提取 DNA，用乙醇沉 淀后， 溶于适量的无菌去离子水中。

1.2  向一无 RNA 酶的 EP 管中依次加入下列试剂：

RNA

1 μg

反应缓冲液(10×)

1 μl

 

 

 

补充经 DEPC 处理的去离子水

至 9 μl

DNase I (1U/μl)

1 μl

注意：如需处理较大量的 RNA 样品， 可以按照比例放大上述反应体系 。如果能在上述反应 体系中加入适量 Ribonuclease inhibitor 以防止 RNA 降解则更佳。

1.3 37°C 孵育 30min。

1.4  向上述反应体系中加入 1 μl 25mM EDTA，65°C 孵育 10min，   以失活 DNase I 。注意：在 没有鏊合剂如 EDTA 等存在情况下加热， RNA 可被水解。

1.5  上述加热处理过的 RNA 样品即可直接用于处理好的 RNA 可用作 RT -PCR 反应的模板。

2 体外 RNA 反转录后模板 DNA 的去除：

2.1  在每含有 0.5 μg 模板 DNA 的反转录反应体系中加入 1U DNase I 。注意：在某些情况下， 模板 DNA 消化所需的 DNase I 的量需通过实验进行摸索。

2.2 37°C  孵育 15min。

2.3  酚/氯仿抽提失活 DNase I。

3  缺口平移进行 DNA 标记

3.1  参考如下表格设置反应：

Reaction Buffer (10×) for DNA Polymerase I

2.5 μl

3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP) *

1.25μl

[α -32P]-dNTP, ~110TBq/mmol (3000Ci/mmol)

1.85 -3.7MBq (50 -100μ Ci)

DNase I (freshly diluted to 0.002U/μl)**

1 μl

DNA Polymerase I, E.coli

0. 5 -1.5 μl (5 -15U)

Template DNA

0.25μg

补充无核酸酶去离子水

至 25μl

* 3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP)：分别取除已经标记的 dNTP 外的 3 种 dNTP(100mM)  各 1 μl  加入到 97μl  的无核酸酶的去离子水中混匀即可 。例如标记的为 dATP，则需混合 dTTP、dCTP 和 dGTP 三种 dNTP 至每种的最终浓度为 1mM。配制好的 dNTP 可存放于 -20°C 以备后续使用。

** DNase I 可以用 1 ×  Reaction Buffer for DNA Polymerase I 进行稀释。

Reaction Buffer (10 ×) for DNA Polymerase I ：   500mM Tris -HCl (pH7.5 at 25°C) ，   100mM MgCl2 ， 10mM DTT。

3.2  立即 15°C 孵育 15~60min。

3.3  上述反应体系中加入 1μl 0.5M EDTA(pH 8.0)终止反应。

3.4  从中取出少量例如 1 μl 检测标记效率 。通常标记效率至少可以达到 108cpm/μg DNA。

3.5  可用 Sephadex G -50 或 Bio -Gel P -60 去除[α -32P]-dNTP，   以纯化获得标记的 DNA。

温馨提示：

为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服， 带手套等。