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主要用途

 细胞培养液氧化应激活性氧（ROS）光泽精化学发光法定量检测试剂是一种旨在通过使用自由基  探针光泽精， 捕获细胞培养上清液中的活性氧族， 使发光物氧化降解并发光， 在化学发光仪（Luminometer） 的帮助下定量检测细胞培养液活性氧族（超氧自由基阴离子） 的生成和数量的而经典的技术方法。该  技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。适用于各种动物和人体细胞培养液的活性氧族的检测。 产  品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定，检测敏感。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基   （hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷   氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-） 次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等   细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿  性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。光泽精（lucigenin），又称硝酸双-N- 甲基吖啶翁

（bis-N-methylacridinium nitrate），是一种带正电荷的发光剂，单价还原后生成光泽精自由基，再与超氧自 由基阴离子反应生成不稳定的中间物光泽精二恶二酮， 由此分解成电激发状态（N－甲基丫啶酮），通过释 放光子，回复到基态。光泽精作为探针，可以特异性检测细胞培养系统超氧自由基阴离子，其发光强度与 超氧自由基阴离子水平成正相关。

产品内容

 清理液（Reagent A）

 发光液（Reagent B）

产品说明书

保存方式

毫升

毫升

1 份

保存  发光液（Reagent B） 在－20℃冰箱里， 严格避免光照； 其余的保存在 4℃冰箱里， 有效保

证 6 月

用户自备

15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

台式离心机：用于去除样品杂质

测试管：用于发光检测用的专用试管

化学发光仪：用于检测化学发光

实验步骤

一、 样品预处理

1 ． 准备 1 瓶 25cm2细胞培养瓶的新鲜待测细胞

2 ． 小心移取细胞培养液到 15 毫升锥形离心管

3 ． 放进 4℃台式离心机离心 10 分钟，速度为 300g

4 ． 小心移取上清液到新的 15 毫升锥形离心管

5 ． 根据上清液容量和细胞数，计算出（N） X 106细胞/毫升

6 ． 放进 37℃培养箱里备用（1 小时内）

二、 测读

测读开始前， 打开化学发光仪， 设定仪器内温度为 37℃预热和整合测读 10 秒或 15 分钟； 然后关掉实验室 的灯光。将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化，严格置于暗室里。然后进行下列操作。

1 ． 准备好测试管，做好标记：阴性对照、样品本底和样品活性

2 ． 移取 xx 微升  清理液（Reagent A）到阴性对照测试管

3 ． 移取 400 微升上述预处理的细胞培养液到样品本底测试管

4 ． 移取 400 微升上述预处理的细胞培养液到样品活性测试管

5 ． 分别加入 xx 微升  发光液（Reagent B）到上述测试管，除样品本底测试管

6 ． 轻轻涡旋混匀

7． 即刻放进 37℃化学发光仪里测读

8． 整合测读 10 秒，获得相对发光单位（relative light unit；RLU）

9． 或者整合测读 15 分钟， 获得光电子读数： X 106 CPM（counted photon per minute）（注意： 可以使用液 体闪烁仪替代）

10．计算 ROS 水平：

（样品活性－样品本底）  ÷              细胞】＝X  106 CPM/毫升＝X  106 CPM/【（N）X 106   细胞】

注意事项

1 ． 本产品为 50 次操作

2 ． 如果测定体系变化，则试剂用量相应变化

3 ． 操作时，须戴手套

4 ． 测试前，细胞培养液须新鲜收集， 1 小时内为最佳

5 ． 样品制备后即刻测读，不宜过夜保存

6 ． 培养液上清须澄清

7 ． 必要时，例如活性氧族过低，可以浓缩样品处理

8 ． 测读的所有步骤均须在暗室里进行

9 ． 如果是注射式化学发光仪，建议测试前后使用无离子水冲洗化学发光仪注射（injector）管道 10 ．本公司提供系列活性氧分析试剂产品

质量标准

1 ． 本产品经鉴定性能稳定

2 ． 本产品经鉴定检测敏感