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 技术背景

多聚ADP核糖聚合酶-1（Poly (ADP-ribose) Polymerase；PARP；EC 2.4.2.30）是一种锌依赖性核酶，广泛存在于真核细胞中。PARP家属由18个成员，其中6个已经被证实，包括PARP-1（占90％）、PARP-2、PARP-3、PARP-4（VPARP）、PARP-5a/5b（tankyrase）等。PARP蛋白由4个结构域构成：DNA结合、切离、自修饰（automodification）、催化等结构域。其功能在于特异性地识别DNA损伤产生的单链或双链DNA断裂，并与之结合而激活，催化将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）转化成烟酰胺（nicotinamide）和多聚ADP核糖分枝聚合体（branched polymers of various poly (ADP-ribose)）的反应，由此引导各种DNA修复蛋白聚集到损伤部位，实施修复，同时调节染色质结构形成（chromatin structure formation）、 细胞分化、繁殖、发育、凋亡、基因表达等，以及对于心脑缺血的反应和肿瘤恶变的作用。抑制PARP活性，可以防止心衰、中风、败血症等引起的组织损害。其中PARP-1由1014氨基酸残基组成，分子量113Kd，是细胞ATP/NAD细胞凋亡系统的主要调节因子。基于人工合成底物ADP核糖对硝基苯酚（ADP-ribose-p-nitrophenol），在损伤的DNA存在的前提下，受到多聚ADP核糖聚合酶-1的作用，释放出显色产物对硝基苯酚（p-nitrophenol），通过分光光度仪检测吸光读数的变化（405nm 波长），来定量分析多聚ADP核糖聚合酶-1的活性。其反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

缓冲液（Reagent C）        毫升

反应液（Reagent D）        微升

底物液（Reagent E）          微升

阴性液（Reagent F）          微升

产品说明书              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

（微型）台式离心机：用于样品制备

比色皿或酶标板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备（总蛋白制备）

1． 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长405nm，并置零 

2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底物液（Reagent E）避免光照；缓冲液（Reagent C）室温下预热

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反应液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 加入xx微升阴性液（Reagent F）

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在25℃温度下孵育2小时

7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景读数

四、 样品测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反应液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 加入5微升待测样品（（20微克核蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白））（注意：样品须清澈）

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在25℃温度下孵育2小时

7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数

五、计算样品活性

六、 酶标板测定

1． 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中

3． 分别加入xx微升反应液（Reagent D）

4． 分别加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 分别加入xx微升阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克核蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）

6． 轻轻摇动酶标板

7． 在25℃温度下孵育2小时

8． 即刻放进酶标仪检测：获得背景读数和样品读数

9． 活性计算：

注意事项

1． 本产品为20次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品须澄清，至关重要 

5． 用户可以选择使用核蛋白替代产品中的总蛋白制备

6． 测定值由低到高变化；反应可持续2小时

7． 比色测定后，比色皿须清洗

8． 样本测定2小时读数高于背景读数表明具有酶活性

9． 建议待测样本蛋白浓度：核蛋白为20微克/5微升；总蛋白为100微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

10． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

11． 多聚ADP核糖聚合酶-1单位活性定义为：在25℃，pH 8.0条件下，每小时内能够释放1微摩尔对硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位

12． 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感