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细胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细胞CDK1/CYCLIN B激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，受到CDK1/CYCLIN B磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中CDK1/CYCLIN B特异活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或纯化酶样品中CDK1/CYCLIN B激酶的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

细胞周期素依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1；CDK1），又称为细胞分裂周期蛋白2（cell division cycle2；CDC2）或p34^cdk1，属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一。其为高度进化保留的激酶复合物，成熟促进因子（maturation promoting factor；MRF）中的催化亚体，含有297氨基酸，与细胞周期素B结合，允许细胞由G2期进入有丝分裂期以及由G1期进入DNA合成期，达到调节细胞生长、DNA复制、细胞分裂等。其磷酸化目标序列为 GGGRSPGRRRRK。基于底物GGGRSPGRRRRK，在ATP的存在下，受到CDK1/CYCLIN B激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析细胞周期素依赖性激酶1/细胞周期素B的特异活性。其反应方式为：

产品内容

清理液（Reagent A）         毫升

裂解液（Reagent B）         毫升

缓冲液（Reagent C）          毫升

酶促液（Reagent D）          微升

反应液（Reagent E）          微升

底物液（Reagent F）         微升

阴性液（Reagent G）          微升

产品说明书               1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

CDK1/CYCLIN B激酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于细胞预处理

100微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤

一、 待测样品准备

1． 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零

三、 背景对照测定

1． 移取65微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入10微升酶促液（Reagent D）

3． 加入10微升反应液（Reagent E）

4． 加入10微升底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入5微升阴性液（Reagent G）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

四、 样品测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反应液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

五、 计算样品活性

六、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里

3． 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）

4． 分别加入xx微升反应液（Reagent E）

5． 分别加入xx微升底物液（Reagent F）

6． 轻轻摇动96孔板

7． 在30℃温度下孵育3分钟

8． 分别加入xx微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）

9． 轻轻摇动96孔板

10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数

11． 活性计算：

注意事项

1． 本产品为25次操作，包括背景操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液

5． 样品须澄清，至关重要 

6． 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定

7． 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟

8． 光度测定后，比色皿须清洗

9． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性

10． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12． 可以使用CDK1/CYCLIN B抑制剂（CGP74514A）作为抑制剂对照（IC50＝0.025微摩尔）或阴性对照

13． CDK1/CYCLIN B激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

14． 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品