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动物细胞高纯内质网分离试剂盒产品说明书

主要用途

动物细胞高纯内质网分离试剂是一种旨在通过机械或化学处理、差速和等密度离心方法，从动物细胞中分离出活性完整而高度纯化的内质网细胞器组分的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其制备物产量高，活性保证，纯度可达99％。适合于各种动物原代和培养细胞（人体、老鼠、兔子等）内质网的制备。可以被用于细胞色素P450系统外源化合物（xenobiotics）代谢、脂类代谢、内质网膜蛋白和腔内蛋白等研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量高。

技术背景

内质网（endoplasmic reticulum；ER）是真核生物的细胞器组分，构成细胞内小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互连接的网络结构，负责蛋白转译、折叠和转运成为细胞膜成分（例如跨膜受体和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），负责钙离子区隔（sequestration），以及糖原、固醇类和其它大分子的生产和储存等功能。内质网分成三种：粗面内质网（Rough endoplasmic reticulum；RER）、滑面内质网（Smooth endoplasmic reticulum；SER）和肌质网（sarcoplasmic reticulum；SR）。根据细胞代谢的需要，粗面内质网和滑面内质网会互相转换。粗面内质网通过核糖体合成蛋白质并分类；滑面内质网进行固醇、碳水化合物和药物代谢等。肌质网的主要功能为储存和释放钙离子。内质网的分离是现代细胞生物学研究的常用手段之一：第一，通过机械或化学方法破裂组织细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得内质网；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的内质网。 

产品内容

清理液（Reagent A）        100毫升

裂解液（Reagent B）        100毫升

净化液（Reagent C）        10毫升

活性液（Reagent D）        100微升

强化液（Reagent E）        5毫升

保存液（Reagent F）        50毫升

高纯液（Reagent G）        25毫升

分层液（Reagent H）        25毫升

产品说明书           1份

保存方式

保存净化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液（12028）或PBS缓冲溶液（12033）：用于清理细胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于细胞脱离

细胞培养液（12052）：用于细胞处理所需的培养基

50毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

6毫升超速离心管：用于超高速离心的容器

4℃台式离心机：用于样品制备

4℃超速离心机：用于样品制备

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织

试管固定支架：用于离心管固定支撑

3号针筒和18号针头：用于收集样品

实验步骤

一、 组织匀浆法

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）冻融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、 1毫升净化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

1． 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（5 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面

2． 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去

3． 重复实验步骤2一次

4． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面

5． 置入37℃培养箱3分种

6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，

7． 分别加入10毫升用户自备的细胞培养液

8． 移入一个50毫升锥形离心管

9． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g

10． 小心抽去上清液

11． 加入10毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀细胞

12． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入5毫升预冷的裂解工作液

15． 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群

16． 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器

17． 在冰槽里用匀浆帮匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项7）

18． 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管

19． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g

20． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解细胞

21． 放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为12000g

22． 小心移出上清液到预冷的6毫升超速离心管——此步骤获得后线粒体组分（post mitochondrialfraction；PMF）

23． 放进4℃超速离心机再次离心60分钟，速度为100000g

24． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒――此步骤获得内质网组分

25． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混匀沉淀物

26． 置于冰槽里备用

27． 准备1个6毫升超速离心管

28． 加入2.5毫升高纯液（Reagent G）

29． 小心沿着管壁，在高纯液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分层液（Reagent H）（注意：避免晃动）

30． 小心沿着管壁，在分层液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述内质网组分（注意：避免晃动）

31． 小心放进4℃超速离心机再次离心30分钟，速度为130000g

32． 小心取出超速离心管：可见上端三分之一处（滑面内质网）和下端三分之一处（粗面内质网）棕色或乳黄色样品带

33． 小心抽去滑面内质网样品带以上的液体

34． 小心收集滑面内质网样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯滑面内质网样品

35． 进一步抽去粗面内质网样品带以上的液体

36． 小心收集粗面内质网样品带到另一个2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯滑面内质网样品

37． 分别加入1至2毫升保存液（Reagent F）

38． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为100000g

39． 小心抽去上清液

40． 分别加入500微升保存液（Reagent F），混匀

41． 放进－70℃冰箱里保存

二、 化学处理法

实验开始前，将试剂盒里的净化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）冻融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、1毫升净化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混匀后，置入冰槽里，标记为裂解工作液。然后进行下列操作。

1． 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（5 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面

2． 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去

3． 重复实验步骤2一次

4． 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面

5． 置入37℃培养箱3分种

6． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落

7． 分别加入10毫升用户自备的细胞培养液

8． 移入一个50毫升锥形离心管

9． 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g

10． 小心抽去上清液

11． 加入10毫升预冷的清理液（Reagent A）

12． 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入5毫升预冷的裂解工作液

15． 涡旋震荡5秒，充分混匀

16． 在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次

17． 加入500微升预冷的强化液（Reagent D）

18． 涡旋震荡5秒，充分混匀

19． 在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项8）

20． 加入5毫升预冷的裂解液（Reagent B），轻轻摇动试管混匀

21． 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g

22． 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解细胞

23． 放进4℃超速离心机离心20分钟，速度为12000g

24． 小心移出上清液到预冷的6毫升超速离心管——此步骤获得线粒体组分（post mitochondrialfraction；PMF）

25． 放进4℃超速离心机再次离心60分钟，速度为100000g

26． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒――此步骤获得内质网组分

27． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混匀沉淀物

28． 置于冰槽里备用

29． 准备1个6毫升超速离心管

30． 加入2.5毫升高纯液（Reagent G）

31． 小心沿着管壁，在高纯液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分层液（Reagent H）（注意：避免晃动）

32． 小心沿着管壁，在分层液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述内质网组分（注意：避免晃动）

33． 小心放进4℃超速离心机再次离心30分钟，速度为130000g

34． 小心取出超速离心管：可见上端三分之一处（滑面内质网）和下端三分之一处（粗面内质网）棕色或乳黄色样品带

35． 小心抽去滑面内质网样品带以上的液体

36． 小心收集滑面内质网样品带到2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯滑面内质网样品

37． 进一步抽去粗面内质网样品带以上的液体

38． 小心收集粗面内质网样品带到另一个2毫升离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯粗面内质网样品

39． 分别加入1至2毫升保存液（Reagent F）

40． 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为100000g

41． 小心抽去上清液

42． 分别加入500微升保存液（Reagent F），混匀

43． 放进－70℃冰箱里保存

注意事项

1． 本产品为10次（5 X 10⁷动物细胞）操作

2． 操作时，须戴手套

3． 操作时，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent F）

4． 所有操作均须在4℃或以下状态进行

5． 建议使用足够的样品量

6． 建议严格控制操作时间

7． 通常匀化次数为20至40下（或细胞颗粒群消失为止）达到80％的组织细胞裂解为理想状态，但不同的细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数

8． 通常孵育5分钟（不宜超过5分钟）达到80％的组织细胞裂解为理想状态，但不同的细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升裂解物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加孵育时间和涡旋震荡次数

9． 对于难以裂解的细胞，例如HeLa细胞，采用物理匀浆法是优先推荐的技术处理

10． 脑组织的内质网沉淀颗粒非常松动，注意操作损失

11． 通常5 X 10⁷动物细胞的内质网含量为500至1000微克蛋白

12． 本产品所获得的内质网纯度达95%以上

13． 内质网的标志蛋白是NADPH细胞色素C还原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）；建议使用 组织NADPH细胞色素C还原酶活性比色法定量检测试剂盒－50303.2

14． 粗面内质网的标志是核糖体RNA（ribosome RNA）；建议使用 RNA荧光（RiboGreen）定量检测试剂盒——20129

15． 本公司提供系列亚细胞结构分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定分离的内质网维持正常活性

3． 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶