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HL50264.2 v.A

组织3-羟-3-甲戊二酰辅酶A（HMG-COA）合成酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

组织3-羟-3-甲戊二酰辅酶A（HMG-COA）合成酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在运用乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A，在HMG-COA合成酶的催化下，使烯醇式乙酰乙酰辅酶A减少致吸光峰值的降低，即采用光度法来测定组织裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液、微粒体，或纯化酶样品3-羟-3-甲戊二酰辅酶A（HMG-COA）合成酶的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

3-羟-3-甲戊二酰辅酶A合成酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA synthase；HMGS；EC2.3.3.10）属于酰基缩合酶（acyl condensing enzyme）家属中的成员之一，是胆固醇通路和甲戊二羟酸通路的重要的限速酶之一，调节胆固醇、类异戊二烯脂以及酮体分子的产生，受到固醇和非固醇分子的反馈抑制。HMG-COA合成酶存在于各种动物、昆虫、植物、真菌，以及某些细菌中。通过催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的生物克莱森缩合反应（Claisen Condensation），生成3-羟-3-甲戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA；HMG）。动物HMG-COA合成酶分成两种亚型：线粒体型和胞浆型。线粒体型占主要，与酮体生成相关，而胞浆型与胆固醇和类异戊二烯脂生物合成相关。细菌HMG-COA合成酶与细胞壁合成、电子传递等有关，例如十一癸烯醇（undecaprenol）、甲萘醌（Menaquinone）和泛醌（ubiquinone）等分子合成。HMG-COA合成酶异常，会导致糖尿病酮症酸中毒（diabetic ketoacidosis；DKA）。 基于底物乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A，在HMG-COA合成酶的催化下，缩合产生3-羟-3-甲戊二酰辅酶A（HMG-COA），其烯醇式（enol form）乙酰乙酰辅酶A的减少，通过吸光峰值的降低变化（303nm 波长），来定量分析3-羟-3-甲戊二酰辅酶A（HMG-COA）合成酶的活性。3-羟-3-甲戊二酰辅酶A（HMG-COA）合成酶反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

缓冲液（Reagent C）        毫升

反应液（Reagent D）        微升

阴性液（Reagent E）          微升

产品说明书              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

（微型）台式离心机：用于样品制备

200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤

一、 样品准备

1． 手术取出动物组织，并秤重500毫克

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （选择步骤）抽去清理液

5． 移入到一个液氮冻存管

6． 即刻放进液氮罐过夜

7． 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）

8． 放进一个15毫升锥形离心管

9． 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 

10． 强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11． 放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12． 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g

13． 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管 

14． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）

15． 放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、 测定准备

1． 开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长303nm，间隔5分钟，读数2次（共10分钟），并置零

2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化 

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反应液（Reagent D）

3． 上下倾倒数次，混匀

4． 在30℃温度下孵育3分钟

5． 加入xx微升阴性液（Reagent E）

6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－10分钟读数）

四、 样品测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反应液（Reagent D）

3． 上下倾倒数次，混匀

4． 在30℃温度下孵育3分钟

5． 加入20微升待测样品（200微克蛋白）（注意：样品须清澈）

6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－10分钟读数）

五、计算样品活性

六、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里

3． 分别加入xx微升反应液（Reagent D）

4． 轻轻摇动96孔板

5． 在30℃温度下孵育3分钟

6． 分别加入xx微升阴性液（Reagent E）或待测样品（200微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）

7． 轻轻摇动96孔板

8． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和10分钟读数

9． 活性计算：

注意事项

1． 本产品为20次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 建议使用比色皿测定

5． 样品须澄清，至关重要

6． 加样后3秒内光度测定

7． 测定值由高到低变化；测定持续10分钟

8． 光度测定后，比色皿须清洗

9． 样本测定0分钟读数高于10分钟读数表明具有酶活性

10． 建议待测样本蛋白浓度为200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）

11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12． 3-羟-3-甲戊二酰辅酶A（HMG-COA）合成酶单位活性定义为：在30℃，pH 7.8条件下，每分钟内缩合产生3-羟-3-甲戊二酰辅酶A（HMG）所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列甲戊二羟酸（MEVALONATE）通路分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感