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细胞柠檬酸合成酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细胞柠檬酸合成酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过柠檬酸合成酶反应系统中释放出巯基辅酶A，使用Ellman试剂后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体等）柠檬酸合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

柠檬酸合成酶（citrate synthase；E.C. 2.3.3.1），又称为柠檬酸生成酶（citrogenase），存在于所有生命体中，主要位于真核细胞线粒体内基质膜中，作为线粒体的定量标记之一。柠檬酸合成酶是三羧酸循环（Tri Carboxylic Acid cycle；TCA cycle）或柠檬酸循环（citric acid cycle）或克雷伯循环（Krebs Cycle）的第一步，其催化来自于乙酰辅酶A（acetyl CoA）的二碳乙酸与四碳草酰乙酸（oxaloacetate）分子的缩合（condensation）反应，生成六碳柠檬酸，释放出能量供细胞使用。柠檬酸合成酶为同源二聚体， 共有437氨基酸。每个亚体含有20个α螺旋体（α－helices）。基于草酰乙酸结合柠檬酸合成酶后，酶的构象发生改变，产生与乙酰辅酶A结合的机会，同时硫酯（thioester）水解，并释放出巯基辅酶A（CoA－SH），与Ellman试剂5，5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析柠檬酸合成酶的活性。柠檬酸合成酶反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

缓冲液（Reagent C）        毫升

反应液（Reagent D）        毫升

底物液（Reagent E）             毫升

阴性液（Reagent F）          毫升

产品说明书              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于脱离细胞

微型台式离心机：用于样品制备

比色皿或酶标板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

一、 样品准备

1． 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零

2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反应液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 在37℃温度下孵育3分钟

6． 加入xx微升阴性液（Reagent F）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（15分钟读数－0分钟读数）

四、 样品测定

1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反应液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 在37℃温度下孵育3分钟

6． 加入50微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（15分钟读数－0分钟读数）

9． （选择步骤）重复实验步骤1至10，测读新的样品

五、计算样品活性

六、 酶标板测定

1． 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中

3． 分别加入xx微升反应液（Reagent D）

4． 分别加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 轻轻摇动96孔酶标板

6． 在37℃温度下孵育3分钟

7． 分别加入xx微升阴性液（Reagent F）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）

8． 轻轻摇动酶标板

9． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数

10． 活性计算：

注意事项

1． 本产品为20次（比色皿）和80次（酶标板）操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 可以使用纯化线粒体（10微克）作为待测样品

5． 建议使用比色皿测定

6． 样品须澄清，至关重要

7． 加样后3秒内比色测定

8． 测定值由低到高变化；测定可持续15分钟

9． 比色测定后，比色皿须清洗

10． 样本测定15分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性

11． 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）

12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

13． 柠檬酸合成酶单位活性定义为：在37℃，pH 8.0条件下，每分钟内能够生成1微摩尔柠檬酸所需的酶量作为一个活性单位

14． 本公司提供系列脂肪酸代谢检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感