技术文章Article 首 页 > 技术文章 > 细胞基质金属蛋白酶9活性比色法定量检测试剂盒说明书
细胞基质金属蛋白酶9活性比色法定量检测试剂盒说明书
点击次数：209 更新时间：2024-04-25
 

细胞基质金属蛋白酶9活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

 

主要用途

 

细胞基质金属蛋白酶9（MMP-9）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过含硫多肽底物以及特定抑制剂存在与否的情况下，受到MMP9的水解，释放出巯基，进而使用Ellman试剂，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或纯化酶样品中基质金属蛋白酶9的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。

 

技术背景

 

基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。基质金属蛋白酶-9，又称明胶酶B（gelatinase-B ）或IV型胶原酶（type IV collagenase），其前体分子量为92kDa，激活后分子量为82kDa以及更小。它的作用目标是天然和变性胶原蛋白（collagens）、纤维连接蛋白（fibronectin）、弹性纤维蛋白（elastin）、层粘连蛋白（laminin）、前体肿瘤坏死因子-α（pro-TNF-α）和白细胞介素及其受体。基质金属蛋白酶-9与肿瘤发展与转移、血管形成、斑秃（alopecia）等疾病有关。基于含硫多肽（thiopeptide）底物Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）-LG-OC2H5，在特异性抑制剂存在与否的条件下，受到MMP9的水解，释放出巯基（sulfhydryl group），进而与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量测定组织基质金属蛋白酶9的特异活性。基质金属蛋白酶2反应系统为：

 

MMP9

Ac-PLG（2-mercapto-4-methyl-pentanoyl）-LG-OC2H5 →  Ac-PLG-SH  +  4-methyl-pentanoyl-LG-OC2H5 

Inhibitor（＋/－）

 

DTNB  +  Ac-PLG-SH  →   TNB +  Ac-PLG-S -S-TNB

 

 

 

产品内容

 

清理液（Reagent A）                 120毫升

裂解液（Reagent B）                  10毫升

缓冲液（Reagent C）                  15毫升

反应液（Reagent D）                  1.5毫升

底物液（Reagent E）                       50微升

阴性液（Reagent F）                   500微升

专性液（Reagent G）                   200微升

产品说明书                1份

 

保存方式

 

保存缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）、专性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和专性液（Reagent G）避免光照；有效保证3月

 

用户自备

 

1.5毫升离心管：用于反应液配制的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

（微型）台式离心机：用于样品制备

培养箱：用于反应孵育

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

 

实验步骤

 

一、 样品准备

 

1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）

2. 小心加入3毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）

5. 加入3毫升清理液（Reagent A），混匀细胞

6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7. 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混匀

10. 转移到预冷的1.5毫升离心管

11. 强力涡旋震荡15秒

12. 置于冰槽里孵育30分钟

13. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15. 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 BCA蛋白质浓度定量试剂盒－HL30031.1）

16. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

二、 测定准备

 

1． 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔1分钟，读数15次（共15分钟），并置零 

2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照

3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

 

三、 样品背景对照测定

 

1． 移取212.5微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入25微升反应液（Reagent D）

3． 加入2.5微升阴性液（Reagent F）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 在37℃温度下孵育3分钟

6． 加入10微升待测样品（100微克总蛋白）（注意：样品须清澈）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（15分钟读数－0分钟读数）

 

四、 样品总活性测定

 

1． 移取212.5微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入25微升反应液（Reagent D）

3． 加入2.5微升底物液（Reagent E）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 在37℃温度下孵育3分钟

6． 加入10微升待测样品（100微克总蛋白）（注意：样品须清澈）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（15分钟读数－0分钟读数） 

 

五、样品非特异活性测定

 

检测开始前，分别移取10微升专性液（Reagent G）和待测样品（注意：100微克细胞裂解蛋白）到1.5毫升离心管，混匀后，放进37℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

 

1． 移取202.5微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入25微升反应液（Reagent D）

3． 加入2.5微升底物液（Reagent E）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 在37℃温度下孵育3分钟

6． 加入20微升上述预处理的待测样品

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（15分钟读数－0分钟读数）

 

六、计算样品活性

 

（一） 样品活性（总活性或非特异活性）

 

[（样品读数－背景读数）X 0.25（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.01（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

 

单位＝微摩尔含硫多肽底物/分钟

 

（二） 样品特异活性

 

样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性

 

七、 酶标仪测定

 

（一） 样品总活性检测

 

1． 在96孔板上做好相应标记：样品背景和样品活性

2． 分别移取84微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中所有孔里

3． 分别加入10微升反应液（Reagent D）到所有孔里

4． 加入1微升阴性液（Reagent F）到样品背景孔里

5． 加入1微升底物液（Reagent E）到样品活性孔里

6． 轻轻摇动96孔板

7． 在37℃温度下孵育3分钟

8． 分别加入5微升待测样品（50微克总蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈）

9． 轻轻摇动96孔板

10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数

11． 活性计算：

 

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.1（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 0.5（光径距离；厘米）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

 

单位＝微摩尔含硫多肽底物/分钟

 

（二） 样品非特异性活性检测

 

检测开始前，分别移取5微升专性液（Reagent G）和待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白）到1.5毫升离心管，混匀后，放进37℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

 

1． 在96孔板上做好相应标记：待测样品

2． 移取79微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里

3． 加入10微升反应液（Reagent D）

4． 加入1微升底物液（Reagent E）

5． 轻轻摇动96孔板

6． 加入10微升上述预处理的待测样品

7． 轻轻摇动96孔板

8． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数

9． 活性计算：

 

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.1（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 0.5（光径距离；厘米）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

 

单位＝微摩尔含硫多肽底物/分钟

 

（三） 样品特异性活性计算

 

样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性

 

注意事项

 

1． 本产品为20次（10个样本；比色皿）和50次（25个样本；96孔板）操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 专性液（Reagent G）严禁反复冻融；有效期为3个月

5． 样品须澄清，至关重要

6． 样品准备要点如下：

a) 样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂

b) 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR）

c) 如果样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂（建议使用胶原酶潜酶活化剂（APMA）－HL12197）

7． 建议使用比色皿测定

8． 样品须澄清，至关重要

9． 加样后3秒内比色测定

10． 测定值由低到高变化；测定可持续15分钟

11． 比色测定后，比色皿须清洗

12． 样本测定15分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性

13． 待测样本为酶粗提样品，其蛋白浓度为20微克/50微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供  BCA蛋白质浓度定量试剂盒HL30031.1）

14． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

15． 如果检测基质金属蛋白酶9抑制剂，在加入底物液（Reagent E）前，37℃下孵育30分钟

16． 可以检测部分或纯化酶样品中基质金属蛋白酶9，则可以省去非特异活性检测步骤

17． 基质金属蛋白酶9酶活性单位浓度定义：在37℃温度下，pH 7.5的情况下，每单位抑制剂敏感性酶在单位时间内（每分钟）水解1微摩尔的含硫多肽底物

18． 本公司提供系列基质金属蛋白酶检测试剂产品

 

质量标准

 

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感