产品目录Products

一、检测原理

本试剂盒采用 ELISA 双抗体夹心法原理。用纯化的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗体包被微孔板，向已包被板微孔中依次加入标准品及待测样本，同时加入 HRP 标记的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗体，形成抗体 - 抗原 - 酶标检测抗体复合物，经过洗涤后加入底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光值（OD 值），通过绘制标准曲线计算样品中 SARS-CoV-2  Nucleoprotein 浓度。

二、试剂盒组成

三、其它实验材料（不提供，但可协助购买）

1. 酶标仪 (主波长 450nm，参考波长 630nm)

2. 高精度可调移液器（已校准）及吸头：0.5 - 10,2 - 20,20 - 200,200 - 1000μl。一次检测样本较多时，建议使用多通道移液器。

3. 自动洗板机或洗瓶

4. 微量振荡器

5. 双蒸水或去离子水

6. 坐标纸

7. 量筒

四、注意事项

8. 试剂盒保存在 2 - 8℃，未用完的标准品，建议丢弃。不可混合使用不同来源或不同批号的试剂盒组分，请在有效期内使用本产品。

9. 浓缩洗涤液低温取出可能会伴有结晶析出，稀释时可在水浴中加热助溶，不影响使用。

10. 各步加样均应使用移液器，并经过校准，以免产生误差。建议一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如样本数量较多，推荐使用排枪加样。

11. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如样本中待测物质含量高于试剂盒检测上限（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样本稀释液稀释一定的倍数（n 倍）后再测定，计算时需乘以总稀释倍数。

12. 为避免交叉污染，在加入不同浓度的标准品、不同样本、不同试剂时谨记及时更换吸头，封板胶纸只限一次性使用。

13. 浓缩酶结合物及显色底物请避光保存，显色底物在添加之前，应保持无色，请勿使用已变为蓝色的显色底物。

14. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

五、样本收集、处理及保存方法

15. 细胞上清液：将培养基移至离心管内，于 4℃下，1500rpm 离心 10 分钟，取上清进行分装并在 - 80℃下保存样品，尽可能减少反复冻融次数。

16. 细胞提取物：吸取培养基并用预冷 PBS 洗涤细胞一次，吸出 PBS，在 100 mm 培养板加入 0.5ml 提取缓冲液。收集细胞至经过预冷的离心管中，短暂涡旋后在冰上孵育 15 - 30 分钟，于 4℃下 13000rpm 离心 10 分钟，将上清液（这里是指可溶性细胞提取物）分装至预冷的离心管中，并于 - 80℃保存，尽可能减少反复冻融次数。

提取缓冲液：100 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM EDTA、1% Triton X - 100、0.5% 脱氧胆酸钠、磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物、PMSF。

17. 若样本无法立即检测，请将其按最小使用量分装， - 20℃ — - 80℃保存，避免反复冻融。如果样本中含有大量颗粒，检测前先离心或过滤去除；室温下解冻，请勿于 37℃或更高的温度加热解冻。

18. 不能检测含 NaN3 的样本，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的活性。

19. 请根据实际情况，将样本做适当倍数稀释（建议根据预试验结果确定稀释倍数）。

六、试剂准备

20. 试剂回温：请在实验前 30min 内，将试剂盒和待测样本置于室温下回温。

21. 洗涤液配制：根据浓缩洗液的浓缩倍数，用双蒸水或去离子水进行相应倍数稀释后备用。

22. 标准品梯度稀释：取出试剂盒提供的标准品（25ng/ml），然后取 5 只聚丙烯试管，各加入 500μl 标准品 / 样本稀释液（S1），按照以下浓度进行 2 倍稀释：25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 ng/ml 进行稀释。25ng/ml 为标准曲线最高点浓度，标准品 / 样本稀释液（S1）作为标准曲线的零点（0ng/ml）。使用过的标准品原液（25ng/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在 - 20～ - 80℃冰箱。

23. 检测抗体工作液：根据试验所需用量，用检测抗体稀释液（S2）将检测抗体浓缩液（100×）稀释成 1 倍应用工作液，请于 30min 内使用。

七、操作步骤

24. 加样：根据试验所需用量，取出相应抗体包被板条，分别将已配制好的标准品、标准品零点（S1）及待测样本以 50μl / 孔加入实验孔底部，尽量不触及孔壁，同时，各实验孔加入检测抗体工作液（50μl / 孔），充分混匀。

25. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 90 分钟。

26. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

27. 显色：每孔加入 100μl 显色底物，用封板胶纸封板后室温显色 10 - 20min。

28. 终止：每孔加终止液 50μl（此时蓝色立转黄色）。

29. 测定：用酶标仪 450nm 波长测定各孔的吸光度（OD 值），测定应在加终止液后 5min 以内进行。

八、结果判断

30. 建议采用双波长读数，即每个标准品和样本的 450nm OD 值减去 630nm OD 值，为最终数值，如果做复孔，求其平均值。

31. 使用计算机软件以吸光度 OD 值为纵坐标 (Y)，相应的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 标准品浓度为横坐标 (X)，生成标准曲线，样本的 SARS-CoV-2 应稀释倍数。

本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线为准

九、试剂盒性能

批内与批间差应小于 10%

十、检测范围

0.78 ng/ml - 25 ng/ml

十一、灵敏度

0.4 ng/ml

十二、常见问题分析及解决办法