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葡萄糖-6-磷酸酶活性检测试剂盒说明书
点击次数：84 更新时间：2025-08-22
 

产品基本信息

  • 检测方法：微量法

  • 产品规格：100T/96S

  • 生产厂家：上海语燕生物技术有限公司

产品组成及保存条件

编号规格储存条件
-100mL×1 瓶4℃保存
A19 mL×1 瓶4℃保存
B粉剂 ×1 支-20℃保存
C粉剂 ×1 支-20℃保存
D试剂 ×1 支-20℃保存


※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

简介

意义

葡萄糖 - 6 - 磷酸酶（glucose 6 phosphatase, G6Pase; EC 3.1.3.9）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是糖异生过程中水解葡萄糖 - 6 - 磷酸生成葡萄糖的限制酶，在维持血糖动态平衡中起重要作用。

原理

G6P 催化葡萄糖 - 6 - 磷酸生成葡萄糖，变旋酶和葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NAD⁺还原生成 NADH，通过在 340nm 下测定 NADH 的生成速率，可反映 G6P 的活性。

自备用品

紫外分光光度计 / 酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿 / 96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理

  1. 细菌或培养细胞：

    • 收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；

    • 按细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）=500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂 1），冰浴条件下超声波破碎（功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；

    • 8000g、4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

  2. 组织：

    • 按组织质量（g）：提取液体积（mL）=1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL ES480），冰浴匀浆；

    • 8000g、4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

  3. 血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤

  1. 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，用蒸馏水调零。

  2. 工作液的配制：临用前将 B、C 和 D 转移到 A 中混合溶解待用；用不完的试剂分装后 - 20℃保存，禁止反复冻融。

  3. 将工作液置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 5 分钟。

  4. 测定操作（在微量石英比色皿或 96 孔板中加入下列试剂）：


试剂名称测定管（μL）
样本10
工作液190


立即混匀，记录 340nm 处初始吸光值 A₁和 2min 后的吸光值 A₂，计算 ΔA=A₂-A₁。


注意：若 ΔA 大于 0.3，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定（使 ΔA 小于 0.3 可提高检测灵敏度），计算公式中需乘以相应稀释倍数。

G6P 活性计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式

  1. 血清（浆）G6P 活力计算
    单位定义：每毫升血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    G6P（nmol/min/mL）=1608×ΔA
  2. 组织、细菌或细胞中 G6P 活力计算
    （1）按样本蛋白浓度计算
    单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    G6P（nmol/min/mg prot）=1608×ΔA÷Cpr
    （2）按样本鲜重计算
    单位定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    G6P（nmol/min/g 鲜重）=1608×ΔA÷W
    （3）按细菌或细胞密度计算
    单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    G6P（nmol/min/10⁴ cell）=3.215×ΔA
    注：V 反总：反应体系总体积，1×10⁻³ L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式

  1. 血清（浆）G6P 活力计算
    单位定义：每毫升血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    G6P（nmol/min/mL）=1608×ΔA
  2. 组织、细菌或细胞中 G6P 活力计算
    （1）按样本蛋白浓度计算
    单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    G6P（nmol/min/mg prot）=3216×ΔA÷Cpr
    （2）按样本鲜重计算
    单位定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    G6P（nmol/min/g 鲜重）=3216×ΔA÷W
    （3）按细菌或细胞密度计算
    单位定义：每 1 万个细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
    G6P（nmol/min/10⁴ cell）=6.43×ΔA
    注：V 反总：反应体系总体积，2×10⁻⁴ L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。


※ 蛋白定量检测建议使用上海语燕生物技术有限公司的 BCA Protein Assay Kit。