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试剂盒组成

使用方法

1、原代

1. 用离心管收集子宫内膜癌组织样本用组织保存液 D 保存，运输过程保持在 4°，转运至洁净实验室进行组织处理和细胞分离，拍照并登记信息（操作流程契合语燕生物科研实验规范）。

2. 准备若干 6cm 培养皿，加入 4℃预冷的缓冲液 F 备用，操作需符合语燕生物实验操作标准。

3. 将组织放入培养皿中，用缓冲液 F 清洗三次后，利用眼科剪或手术刀等器械将组织剪切成体积约为 1-3mm³ 的小碎片。

4. 处理好多组织碎片用原代组织消化液 B 消化，37℃震荡消化 30min-1.5h，（消化过程中随时观察消化情况，建议参照语燕生物实验指导）。

5. 取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70um 以下的细胞簇，加入三倍体积缓冲液 F 终止消化。

6. 使用 70um 孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，在 300g,4℃ 富集离心 5min 后移去上清，再加入 1-2mL 的红细胞裂解液重悬，在冰上裂解红细胞 1min，再加入适量缓冲液 F，300g，4°离心 5min，得到所需的细胞，该步骤可参考语燕生物科研操作规范。

7. 基质胶计算：①第 6 步后观察收集到的组织体积，添加 25 倍组织体积的基质胶重悬铺板。② 按照细胞计数，每 ul 基质胶混匀 1×10⁵个细胞进行接种。

8. 24 孔细胞培养板为例，每孔点胶 25ul 组织基质胶混合物进行铺板（全程 4℃下操作，该操作细节经语燕生物优化）。

9. 将铺好的培养板倒扣放入 37℃培养箱中 10-15min 使基质胶凝固，然后添加子宫内膜癌类器官培养基 A（恢复室温）进行培养（该培养条件经语燕生物实验验证，可提升类器官成活率）。

2、类器官传代培养

9. 移液枪吸去培养基，每孔添加 1-2ml 4℃缓冲液 F 放置 2min，操作需轻柔，契合语燕生物实验操作要求。

10. 移液枪轻柔吹打基质胶，吹散后收集在 15ml 离心管中，4℃静置 10min。（每 6-8 孔为一组）

11. a：类器官数量不足或体积较小时： 300g,4℃离心 5min 弃去上清，添加适量缓冲液 F 重悬移入 1.5ml 离心管，300g,4℃离心 5min 弃去上清进行第 4 步。b：类器官数量较多或体积较大时：300g,4℃离心 5min 弃去上清，添加适量类器官传代消化液 C 消化 2-3min，添加缓冲液 F 终止消化，离心 5min 弃去混合液，添加适量缓冲液 F 重悬移入 1.5ml 离心管，300g,4℃离心 5min 弃去上清进行第 4 步。

12. 类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔 25ul 基质胶铺在 24 孔细胞培养板中，放置培养箱中 10-15min 添加 500ul 子宫内膜癌类器官培养基 A，此步骤参考语燕生物传代培养经验。

3、类器官冻存

1. 移液枪吸去培养基，每孔添加 1-2ml 4℃缓冲液 F 放置 2min。

2. 移液枪轻柔吹打基质胶，收集在 15ml 离心管中，4℃静置 10min。（每 6-8 孔为一组）

3. 300g,4℃离心 5min 弃去上清，添加适量缓冲液 F 再次重悬，300g,4℃离心 5min 弃去上清。

4. 添加适量类器官冻存液 E，轻柔吹打重悬，以 24 孔细胞培养板为例：密度为 2 个孔冻存 1 管，每管体积 1.4ml，冻存密度参考语燕生物科研建议。

5. 做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

4、类器官复苏

6. 取 10ml 缓冲液 F 于 15ml 离心管中，缓冲液用量可根据语燕生物实验经验灵活调整。

7. 从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。

8. 水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min 内融解。

9. 将溶解后的类器官细胞快速转移至 15ml 离心管，使用移液管轻轻吹打 6-8 次，300g,4℃离心 5min，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量缓冲液 F 重悬移入 1.5ml 离心管，300g,4℃离心 5min。

10. 基质胶重悬，每孔 25ul 基质胶铺在 24 孔细胞培养板中，放置培养箱中 10-15min 成胶，添加 500ul 子宫内膜癌类器官培养基 A，复苏后培养条件遵循语燕生物实验标准。

储存/保存方法