技术文章Article 首 页 > 技术文章 > 斑马鱼磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α(p-AMPKα)酶联免疫分析试剂盒使用说明书
斑马鱼磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α(p-AMPKα)酶联免疫分析试剂盒使用说明书
点击次数：43 更新时间：2026-04-20
 
本试剂盒仅供科学研究使用。
规格：96T
检测范围：0.2U/L - 9U/L

适用范围

本试剂盒用于测定斑马鱼血清、血浆及相关液体样本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）活性。

实验原理

本试剂盒采用双抗体夹心法检测样本中斑马鱼p-AMPKα含量。以纯化的斑马鱼p-AMPKα特异性抗体包被微孔板，制备固相抗体；向包被后的微孔中依次加入待测样本、HRP标记的p-AMPKα抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；完成充分洗涤后加入TMB底物显色。TMB在HRP催化下呈现蓝色，经酸性终止液作用转化为稳定黄色，显色深浅与样本中p-AMPKα含量呈正相关。使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度（OD值），通过标准曲线计算得到样本中p-AMPKα的浓度。

试剂盒组成

  1. 30倍浓缩洗涤液 20ml×1瓶

  2. 酶标试剂 6ml×1瓶

  3. 酶标包被板 12孔×8条

  4. 样品稀释液 6ml×1瓶

  5. 显色剂A液 6ml×1瓶

  6. 显色剂B液 6ml×1瓶

  7. 终止液 6ml×1瓶

  8. 标准品（16U/L） 0.5ml×1瓶

  9. 标准品稀释液 1.5ml×1瓶

  10. 说明书 1份

  11. 封板膜 2张

样本要求

  1. 样本采集后应尽快完成前处理，处理完成后优先即刻开展实验；无法立即实验的样本，可置于-20℃条件保存，避免反复冻融。

  2. 本试剂盒不适用含NaN₃的样本，NaN₃会抑制辣根过氧化物酶（HRP）活性，干扰检测结果。

操作步骤

1. 标准品梯度稀释

取配套原倍标准品，使用标准品稀释液按等体积梯度稀释，制备系列标准品：

  • 5号标准品 8U/L：150μl原倍标准品 + 150μl标准品稀释液

  • 4号标准品 4U/L：150μl 5号标准品 + 150μl标准品稀释液

  • 3号标准品 2U/L：150μl 4号标准品 + 150μl标准品稀释液

  • 2号标准品 1U/L：150μl 3号标准品 + 150μl标准品稀释液

  • 1号标准品 0.5U/L：150μl 2号标准品 + 150μl标准品稀释液

2. 加样

实验设置空白对照孔、标准品孔、待测样本孔。

  • 空白对照孔：不加入标准品、待测样本及酶标试剂，其余操作与其余孔一致

  • 标准品孔：每孔准确加入50μl对应浓度标准品

  • 待测样本孔：先加入40μl样品稀释液，再加入10μl待测样本，样本最终稀释倍数为5倍

加样时将液体加至孔底，避免触碰孔壁，加样后轻轻晃动混匀。

3. 第一次温育

使用封板膜密封微孔板，37℃恒温条件温育30分钟。

4. 洗涤液配制

将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍，混匀后备用。

5. 第一次洗涤

轻轻揭去封板膜，弃去孔内液体，充分甩干；每孔加满稀释后的洗涤液，静置30秒后弃去液体，重复操作5次，洗涤完成后将微孔板拍干。

6. 加酶标试剂

除空白对照孔外，其余每孔加入50μl酶标试剂。

7. 第二次温育

密封微孔板，37℃恒温条件温育30分钟。

8. 第二次洗涤

操作步骤与第一次洗涤一致。

9. 显色

每孔依次加入50μl显色剂A液、50μl显色剂B液，轻轻震荡混匀，37℃条件下避光显色10分钟。

10. 反应终止

每孔加入50μl终止液，终止显色反应。

11. 吸光度测定

以空白对照孔调零，在450nm波长下依次测定各孔OD值，所有检测需在加入终止液后15分钟内完成。

结果计算

以标准品浓度为横坐标，对应测得的OD值为纵坐标，绘制标准曲线；根据待测样本的OD值，从标准曲线中查得对应浓度，乘以样本稀释倍数，即为样本中p-AMPKα的实际浓度。也可通过标准品浓度与对应OD值建立直线回归方程，将样本OD值代入方程计算浓度，再乘以稀释倍数得到实际浓度。

注意事项

  1. 试剂盒从低温冷藏环境取出后，需在室温环境平衡1小时后再使用；酶标包被板开封后未使用完毕的板条，需及时装入密封袋密封保存。

  2. 浓缩洗涤液低温存放可能出现结晶析出，稀释时可水浴加温助溶，处理后不影响检测结果。

  3. 实验加样需使用校准合格的加样器具，控制单次加样时长，减少操作误差。

  4. 每次实验均需同步制备标准曲线，样本检测值超出线性范围时，可先行稀释后再检测，结果计算时乘以对应总稀释倍数。

  5. 封板膜为一次性使用用品，避免交叉污染；显色底物需避光存放。

  6. 实验需严格按照本说明书流程操作，检测结果以酶标仪实测读数为准。

  7. 实验样本、洗涤液及实验废弃物，需按实验室相关规范处理。

  8. 不同生产批号的试剂盒组分不可混用。

保存条件及有效期

  1. 试剂盒保存条件：2-8℃低温冷藏

  2. 有效期：6个月