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通用型胆固醇排出（effux）转运功能荧光检测试剂盒产品说明书

主要用途

通用型胆固醇排出（effux）转运功能荧光检测试剂是一种旨在使用使用二吡咯亚甲基二氟化硼标记的胆固醇（BODIPY-Cholesterol）荧光探针，整合进细胞膜，在接受体（acdeptor）的存在下，显示胆固醇排出的变化，来定量分析细胞内胆固醇排出转运活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物或人体细胞等胆固醇排出转运活性的检测，以及抑制剂或诱导剂筛选，血浆接受体的分析。可应用于心血管疾病、代谢和神经退行病变、感染性和生殖性疾病的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

胆固醇（cholesterol）是一类称之为固醇类（sterols）或聚类异戊二烯（polyisoprenoid）或三萜皂甙元（triterpene）的多环化合物（polycyclic compound）。其分子式为cholest-5-en-3β-ol。胆固醇以游离（free form）和酯化结合（ester）两种形式广泛存在于所有动物体内，主要以游离形式循环于血液中，以脂化形式传运和贮存。胆固醇在膜功能和脂代谢以及激素合成中起着重要作用，与肝脏疾病、甲状腺疾病、动脉硬化和心脏疾病密切相关。动脉血管壁上的组织和细胞内胆固醇排出转运为逆向胆固醇转运（reverse cholesterol transport；RCT）过程的早期一步，尤其是粥样硬化斑块上的组织细胞。逆向胆固醇转运是肝外细胞，包括源于巨噬细胞的泡沫细胞（foam cell），转运过量的胆固醇回到肝脏，供胆汁合成和分泌，降低周边脂类负担，调节细胞内胆固醇内平衡。在精子细胞，胆固醇排出转运与授精功能有关。排出转运通过液相弥散、膜蛋白清道夫受体B1（scavenger receptor B1；SRB1）、ABCG1（ATP-binding cassette G1）和ABCA1等通路调节，由源于单核细胞的巨噬细胞中排出，与血浆中的接受体（acceptor）结合，包括载脂蛋白A1（apolipoprotein A1）、载脂蛋白E、高密度脂蛋白（HDL）等。其中ABCA1具有维持组织正常胆固醇水平的功能。一旦突变，则导致丹吉尔病（Tangier disease）。 巨噬细胞胆固醇排出转运与粥样硬化成负相关。通过使用二吡咯亚甲基二氟化硼（dipyrromethene boron difluoride；BODIPY）标记的胆固醇（BODIPY-Cholesterol）荧光探针，整合进细胞膜，具有光稳定和天然胆固醇特性，在接受体（acdeptor）的存在下，显示胆固醇移动的变化，由荧光分光光度仪（激发波长485nm，散发波长520nm）检测，来定量分析细胞内胆固醇排出转运活性。  

产品内容

清理液（Reagent A）         毫升

标记液（Reagent B）         毫升

平衡液（Reagent C）         毫升

受体液（Reagent D）         毫升

产品说明书            1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免光照；有效保证6月

用户自备

细胞培养箱：用于反应孵育

96孔细胞板：用于荧光分析的容器

荧光酶标仪：用于荧光定量分析

实验步骤

一、 测定准备

1． 开启并设定好荧光酶标仪（温度为25℃）：激发波长为485nm，散发波长520nm，间隔30分钟测读1次；增益倍数100至200 

2． 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置于室温下冻融预热，避免光照。然后进行下列操作

二、 荧光测定

1． 准备1个96孔板细胞培养板，标记2个孔：待测样品孔和空白对照孔（注意：其间间隔3个孔）

2． 每孔铺板50000待测细胞

3． 放进37℃细胞培养箱里，孵育24小时

4． 分别小心抽去培养液

5． 分别加入xx微升清理液（Reagent A）

6． 分别小心抽去清理液（Reagent A）

7． 分别加入xx微升标记液（Reagent B）

8． 放进37℃细胞培养箱里，孵育24小时，避免光照

9． 分别小心抽去标记液（Reagent B）

10． 分别加入xx微升清理液（Reagent A）

11． 分别小心抽去清理液（Reagent A）

12． 分别加入xx微升平衡液（Reagent C）

13． 放进37℃细胞培养箱里，孵育18小时，避免光照

14． 分别小心抽去平衡液（Reagent C）

15． 分别加入xx微升清理液（Reagent A）

16． 分别小心抽去清理液（Reagent A）

17． 重复实验步骤15至16二次

18． 加入xx微升受体液（Reagent D）到待测样品孔（注意：用户可以进行各种抑制、诱导等处理）

19． 加入xx微升清理液（Reagent A）到空白对照孔

20． 放进37℃细胞培养箱里，孵育4小时，避免光照（注意：孵育期间，可以每隔30分钟测读）

21． 即刻放进荧光酶标仪（激发波长为485nm，散发波长520nm）：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）――RFU升高，表明胆固醇排出转运功能活性增强

22． 或构建排出转运曲线：纵座标（Y）为相对荧光单位（RFU），横座标（X）为时间（分钟）

23． 或构建抑制曲线（设定终点6小时）：纵座标（Y）为相对荧光单位（RFU），横座标（X）为抑制剂浓度（微摩尔）

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 本产品适合使用人单核细胞（human monocytes）、人单核巨噬细胞THP-1（THP-1 human monocyte-macrophages）、鼠巨噬细胞RAW 264.7 （murine macrophages、HeLa cells）、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells；HUVEC）、乳仓鼠肾BHK-21 细胞、人和小鼠成纤维细胞（human and mouse fibroblasts）、HepG2 人肝癌细胞（human hepatocarcinoma cells）等细胞类型 

3． 操作时，须戴手套

4． 孵育时，避免光照

5． 如果为悬浮细胞，建议使用孔板离心机换液；或使用1.5毫升离心管操作

6． 建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析

7． 用户根据实验情况，可以调整终点时间为4小时

8． 用户可以在某个时间点，加入抑制剂，观察排出转运走势变化

9． 本公司提供系列胆固醇转运功能（transport/uptake）分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰