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PCR技术原理剖析- 实时荧光定量
点击次数：2093 更新时间：2013-08-02
 

 实时荧光定量 PCR技术原理

 

   聚合酶链式反响 （ PCR） 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应完毕之后，我们能够经过凝胶电泳的办法对扩增产品进行定性的分析，也能够经过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的剖析。无论定性或是定量剖析，剖析的都是PCR终产品。所谓的实时荧光定量PCR即是通过对PCR扩增反响中每一个循环产品荧光信号的实时检测然后完成对开始模板定量及定性的剖析。在实时荧光定量PCR反响中，引入了一种荧光化学物质，跟着PCR反应的进行，PCR反应产品不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

 

 

荧光扩增曲线扩增曲线能够分红三个期间

 

荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光布景信号所掩盖，我们无法判别产品量的变化。而在平台期，扩增产品已不再呈指数级的增长。 PCR 的终产品量与开始模板量之间没有线性关系，所以依据后的 PCR 产品量不能计算出开始 DNA 拷贝数。只要在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产品量的对数值与开始模板量之间存在线性关系，咱们能够挑选在这个阶段进行定量分析。为了定量和对比的便利，在实时荧光定量 PCR 技能中导入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它能够设定在荧光信号指数扩增期间任意方位上。每个反应管内的荧光信号抵达设定的域值时所阅历的循环数被称为 CT 值（threshold value）。