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猴狂犬病毒（RV）ELISA试剂盒使用说明书

目的：该试剂盒使用于检测猴血清，血浆及相关液体样本中狂犬病毒（RV）。

猴狂犬病毒（RV）ELISA试剂盒实验原理：该试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中猴狂犬病毒（RV）。用纯化的猴狂犬病毒（RV）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可以与样品中狂犬病毒（RV）相结合，经过洗涤去除未结合的抗体和其他成分后再和HRP标记的狂犬病毒（RV）抗体想结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加入底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下转化为终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值进行对比，从而判定标本中猴狂犬病毒（RV）是否存在。

猴狂犬病毒（RV）ELISA试剂盒样本处理和要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心月20分钟（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如果出现沉淀，需要再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心月20分钟（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如果有沉淀形成，需要再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心约20分钟（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如果有沉淀形成，需要再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心约20分钟（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心约20分钟（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如果有沉淀形成，需要再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍需保持在2-8℃。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心约20分钟（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后应尽早进行提取，提取时要按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若果不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，必须避免反复冻融。

7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

猴狂犬病毒（RV）ELISA试剂盒操作步骤：

1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）。

2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触碰到孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后防止在置于温度为37℃的温度下温育30分钟。 

4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 

7.温育：同3。

8.洗涤：同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立即转变为黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

猴狂犬病毒（RV）ELISA试剂盒结果判定：

试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10临界值（CUT OFF）。

计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15阴性。

判定：1、样品OD值< 临界值（CUT OFF）者为狂犬病毒（RV）阴性阳性。

      2、样品OD值≥ 临界值（CUT OFF）者为狂犬病毒（RV）阳性。