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免疫荧光法测定抗原的基本原则以及注意事项
点击次数：1691 更新时间：2013-08-29
 

 采用直接免疫荧光法测定抗原

基本原则
荧光素标记在相应的抗体与相应的抗原，直接反应。简单，特异性高的优点，非特异性荧光染色少。缺点是灵敏度低；每个检查抗原要求荧光抗体的制备。免疫病理学检查方法常用于细菌，病毒和其他快速检查和活检，皮肤活检。
仪器和试剂
L磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol／，pH7.4
抗体溶液的荧光标记物：0.01mol／L PBS，pH7.4稀释
l缓冲甘油：纯无荧光甘油9 + pH9.2 0.2m碳酸盐缓冲液1例分析。
l漆三桶（用0.01mol／PBS，pH7.4 1500ml）
我覆盖的搪瓷盒（一层纱布垫铺浸泡）
荧光显微镜
我滑架
L滤波器
我37℃温箱等。
实验程序
1滴0.01 mol/L PBS，pH7.4的检测样张，10min后试样的丢弃，保持一定的湿度。
荧光标记的2抗体溶液加入适当稀释，并*覆盖件，覆盖釉质瓷箱下，保温时间（参考：30min）。
3拆下滑动，滑架，先用0.01mol/L，pH7.4 PBS冲洗，然后根据0.01mol/L秩序，pH7.4 PBS三缸浸泡3-5分钟，每个气缸，不时振荡。
4删除幻灯片，用滤纸吸去多余的水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，布满了。
5立即用荧光显微镜。具体的观察到的荧光强度，一般可用“+”的意思：
（-）无荧光；荧光（±）可疑很弱；（+）荧光较弱，但清晰可见；（2+）荧光（+ + +——+ + + +）荧光闪闪发光。检测到特异性荧光染色强度试件是“+”，以及各种控制显示器（+）或（-），可以被看作是积极的。
注意事项
1对荧光标记的抗体稀释，以确保抗体蛋白有一定的浓度，一般不应超过1:20稀释，低浓度的荧光抗体，导致太弱，观察。
2染色温度和时间需要根据样品和抗原不同而异，染色时间可以从10分钟到30个小时，一般民有足够的。染色采用室温温度（25℃），高于37℃可以提高染色效果，但不耐热抗原（如日本脑炎病毒）可以用来在0-2℃温度低，延长染色时间。低温染色过液是37℃30分钟效果好的多。
3为了保证荧光染色的正确性，*次测试设置下列控制，排除干扰的一些非特异性荧光染色。
（1）样品的荧光控制：1-2 0.01 mol/L PBS pH7.4的标本。
（2）比控制（抑制）：与特定的抗体未标记的样本，再加上荧光标记的特异性抗体。
（3）阳性对照：已知的阳性标本用特异性荧光抗体。
如果样品荧光控制和具体控制无荧光或荧光弱，积极控制和检测的标本显示很强的荧光，特异性阳性染色。
4一般标本比高压汞灯下照射3min，荧光减弱，荧光在的观察标本染色，随着时间的延长，其荧光强度降低。