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人胚胎干细胞保存所需材料

  由军事医学科学院实验动物中心提供清洁级孕13.5d ICR小鼠，用于制备小鼠成纤维细胞饲养层，处置符合动物伦理学标准的动物实验的过程。人胚胎干细胞系PKU由北京大学第三医院生殖中心建立并提供;kryo-550-16程序降温仪为英国planner公司产品,由液氮压力泵、液氮罐、层流冷冻箱、温度传感器组成。

人胚胎干细胞实验方法

   人胚胎干细胞系接种在PKU小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，Ⅳ型胶原酶消化和通道，分成人胚胎干细胞的三组冷冻保存。程序降温法:用吸管将消化后人胚胎干细胞吹成若干团块,取65个团块移入配制的冻存液中,装入麦管进行三段式降温,即22℃~-7℃,每分钟降温2.5℃→-7℃置核后停留5min→-7℃~-30℃,每分钟降温0.3℃→-30℃~-150℃,每分钟降温10℃。降至-150℃时置液氮中保存。

   改进的慢速冷冻法：一种包含人类胚胎干细胞培养及血清替代管，B管中的人类胚胎干细胞和二甲亚砜，颗粒60进入管道A，B和随后的液体移管的培养液中，混合-70℃，前两天搬进液氮。改进的慢速冷冻法：一种包含人类胚胎干细胞培养及血清替代管，B管中的人类胚胎干细胞和二甲亚砜，颗粒60进入管道A，B和随后的液体移管的培养液中，混合-70℃，前两天搬进液氮。传统慢速冻存法:将60个团块直接放入添加二甲亚砜的人胚胎干细胞培养基中混匀,分装入冻存管,-4℃放置1h,-70℃第2天移入液氮长期保存。

人胚胎干细胞实验后的评估

   融化后，将细胞保持完整和不分散从人胚胎干细胞聚集体回收的形态，回收率比较三组细胞，状态复制的生长，分化的克隆程度。鉴定程序降温组人胚胎干细胞的生物学特性。复苏率:程序降温组、改良慢速冻存组、传统慢速冻存组的细胞复苏率分别为78.5%、56.7%和23.3%,组间比较差异有显著性意义（x2=6.81~13.89,P0.01）。

   生物学特性：第10代后解冻程序酷胚胎干细胞染色体核型正常，表面抗原鉴定人类胚胎干细胞特异性生物学特性的组：第10代后核型正常的解冻程序酷团的胚胎干细胞，人胚胎干细胞特异性表面抗原SSEA-4及TRI-1-81表达呈阳性,RT-PCR可检测到nanog基因表达,SSEA-4及OCT-4阳性表达率分别为83.44%、89.38%。结论:①程序降温法是冷冻保存人胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和生物学特性。②在不具备程序降温仪的条件下,采用改良慢速冻存法保存胚胎干细胞也是可行的。