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真菌/酵母细胞线粒体损伤/氧化荧光测定试剂盒实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（Reagent C），混匀后，将染色工作液置入暗室里。同时开启荧光显微镜或荧光光度仪。然后进行下列操作。

• 活体染色
• 准备好1毫升新鲜的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107细胞/毫升）
• 移入到1.5毫升离心管
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重复实验步骤5至7一次
• 加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混匀（注意：参见注意事项6）
• 放进20℃培养箱里孵育20分钟
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx微升预冷的清理液（Reagent A），混匀
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察（定性检测）：
• 移出5微升在载玻片上，放上盖玻片
• 即刻进行载玻片压片（选择下列其中一种）

（A）激发波长580nm，散发波长630nm

红光减弱，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

（B）激发波长495nm，散发波长519nm

绿光减弱或降低，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

• 或使用荧光分光光度仪

• 移取500微升染色后的细胞样品到用户自备的1毫升比色皿
• 加入xx微升清理液（Reagent A）
• 上下倾倒混匀
• 即刻放进荧光分光光度仪测读：滤波器激发波长580nm，散发波长630nm或滤波器激发波长495nm，散发波长519nm：活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）――相对荧光单位（RFU）降低

• 固定染色

• 准备好1毫升新鲜的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 107细胞/毫升）
• 加入到1.5毫升离心管
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重复实验步骤5至7一次
• 加入xx毫升－20℃预冷的固着液（Reagent D），混匀
• 放进－20℃冰箱里孵育20分钟
• 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重复实验步骤11至13二次
• （选择步骤）置于100瓦超声仪下，功率20％，猝击5秒一次（分离集聚一起的细胞）
• 加入xx毫升上述配制的染色工作液，充分混匀（注意：参见注意事项6）
• 放进20℃培养箱里孵育20分钟
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入xx微升预冷的清理液（Reagent A），混匀
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察（定性检测）：
  • 移出5,微升在载玻片上，放上盖玻片
  • 即刻进行载玻片压片（选择下列其中一种）

（A）激发波长580nm，散发波长630nm

红光减弱，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

（B）激发波长495nm，散发波长519nm

绿光减弱或降低，表明活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）

• 或使用荧光分光光度仪

• 移取500微升染色后的细胞样品到用户自备的1毫升比色皿
• 加入xx微升清理液（Reagent A）
• 上下倾倒混匀
• 即刻放进荧光分光光度仪测读：滤波器激发波长580nm，散发波长630nm或滤波器激发波长495nm，散发波长519nm：活性氧族含量高，脂类物质降解，线粒体质重降低（线粒体损伤或氧化）――相对荧光单位（RFU）降低