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细胞/组织溶酶体粗提分离试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

细胞/组织溶酶体粗提分离试剂是一种旨在从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的溶酶体细胞器的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于动物软组织（肝或脑组织）和培养细胞的溶酶体的制备。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度俱佳。

技术背景

溶酶体（lysosome）是一种普遍存在于真核细胞中的细胞器，含有酸性水解酶，例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等，分解各种细胞残渣和废弃物质，包括过多的或破损的其它细胞器、食物颗粒、吞噬的细菌和病毒等。其大小为0.5至1.5微米，球圆形，溶酶体内pH为5.0左右。溶酶体功能异常会引起溶酶体贮积症（1ysosomal storage disorders；LSDs），例如家族性白痴病（Tay-sachs disease）和庞贝氏症 （Pompe’s disease）。溶酶体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的常用的手段之一。从任何组织或细胞分离溶酶体的技术方法基本上采用：*，通过机械或化学方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得溶酶体；甚至，第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的溶酶体。 

产品内容

清理液（Reagent A）                                  毫升
裂解液（Reagent B）                                  毫升
净化液（Reagent C）                                  毫升
强化液（Reagent D）                                  毫升
分离液（Reagent E）                                  毫升
保存液（Reagent F）                                  毫升
产品说明书                                              1份
                                                 
保存方式

保存净化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月 

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶或PBS缓冲溶液：用于清理细胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于细胞脱离
*细胞培养液：用于细胞处理所需的培养基
15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作的容器
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
4℃超速离心机：用于分离细胞器成分
DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞

实验步骤

一、动物软组织溶酶体分离（组织匀浆法）

实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。（若需要完整版说明书可以直接客服！）

1．手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（实验前使动物空腹12至24小时） 
2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．即刻用刀片切碎组织
5．放进一个预冷的15毫升锥形离心管
6．加入xx毫升预冷的裂解工作液
7．涡旋震荡5秒，充分混匀
8．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
9．在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）（注意：参见注意事项8）
10．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
11．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
12．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
13．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为12000g
14．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒 
15．加入xx毫升预冷的分离液（Reagent E），混匀
16．置于冰槽里孵育15分钟
17．放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为25000g
18．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得溶酶体沉淀物
19．（选择步骤）加入xx毫升预冷的保存液（Reagent F）
20．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心15分钟，速度为25000g
21．（选择步骤）小心抽去上清液
22．加入xx微升保存液（Reagent F），充分混匀
23．即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里

二、动物软组织溶酶体分离（化学处理法）

实验开始前，将－20℃冰箱里的净化液（Reagent C）取出冻融，然后移出xx毫升净化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升锥形离心管里，混匀后，标记为裂解工作液，放进冰槽里备用。然后进行下列操作。（本说明书由上海哈灵生物科技有限公司提供）

1．手术取出动物组织，并秤重以确定1克组织重量（实验前使动物空腹12至24小时） 
2．（选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．移入一个液氮冻存管
5．即刻放入液氮罐XX
6．次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）
7．放进一个15毫升锥形离心管
8．加入xx毫升预冷的裂解工作液
9．涡旋震荡5秒，充分混匀
10．在冰槽里孵育2分钟，期间涡旋震荡5秒一次
11．加入xx微升预冷的强化液（Reagent D）
12．涡旋震荡5秒，充分混匀
13．在冰槽里孵育5分钟，期间涡旋震荡5秒二次（注意：参见注意事项9）
14．加入xx毫升预冷的保存液（Reagent E），轻轻摇动试管混匀
15．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
16．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
17．放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为12000g
18．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒 
19．加入xx毫升预冷的分离液（Reagent E），混匀
20．置于冰槽里孵育15分钟
21．放进4℃超速离心机离心15分钟，速度为25000g
22．小心抽去上清液，保留沉淀颗粒——此步骤获得溶酶体沉淀物
23．（选择步骤）加入3毫升预冷的保存液（Reagent F）
24．（选择步骤）放进4℃超速离心机再次离心15分钟，速度为25000g
25．（选择步骤）小心抽去上清液
26．加入500微升保存液（Reagent F），充分混匀
27．即刻移入1.5毫升离心管，放进－70℃冰箱里