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细胞内氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途
细胞内氧化应激活性氧（ROS）高质荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素
二乙酯，在细胞氧化条件下，产生荧光，来定量检测细胞内活性氧族的生成和增加的而经典的技术方
法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和
营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基
（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧
自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）
次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等
细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二
氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是
取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升级产品，一种*
自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。一旦被过氧化氢、羟自由基或氢氧基、过氧
化基、次氯酸等氧化，便产生荧光。据此测定细胞内活性氧族的浓度。
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
染色液（Reagent B） 微升
稀释液（Reagent C） 毫升
保存液（Reagent D） 毫升
产品说明书1 份
保存方式
保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6 月
用户自备
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（HL12024）：用于细胞脱离
*细胞培养液（HL12052）：用于细胞操作所需的培养基
15 毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器
1.5 毫升离心管：用于细胞染色的容器
血细胞计数仪：用于细胞计数
台式离心机：用于沉淀细胞
细胞流式仪：用于细胞荧光分析
（共聚焦）荧光显微镜或：用于观察荧光细胞
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荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析
实验步骤
一、间接法
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）
放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的1.5 毫升离心管，加入xx 微升稀
释液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。
1． 准备1 瓶25cm2 细胞培养瓶的待测细胞
2． 小心抽去细胞培养液
3． 加入xx 毫升清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面
4． 小心抽去清理液（Reagent A）
5． 加入1 毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
6． 置入37℃培养箱1 分种
7． 振动培养瓶，使细胞脱落
8． 加入4 毫升用户自备的*细胞培养液
9． 移入15 毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）
10．移取10 微升在血细胞计数仪上进行细胞计数
11．移出1 X 106 细胞到新的15 毫升锥形离心管
12．放入台式离心机离心5 分钟，速度为300g
13．小心抽去上清液
14．加入xx 毫升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液，轻柔混匀
15．放进37℃恒温水槽孵育20 分钟，避免光照
16．放入台式离心机离心5 分钟，速度为300g
17．小心抽去上清液
18．加入预冷的xx 微升保存液（Reagent D），轻柔混匀细胞颗粒群
19．放进冰槽里
20．选择下列方式之一进行操作：
a) 即刻进行细胞流式仪分析：波长488nm 氩离子激光，观察50000 个细胞以上――
波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高
b) 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：
1）移取10 微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片
2）激发波长490nm，散发波长530nm――
绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高
c) 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：
1）移取400 微升上述细胞悬液到1 毫升比色杯
2）加入xx 微升保存液（Reagent D）
3）上下倾倒混匀数次
4）放进荧光分光光度仪：激发波长490nm，散发波长530nm――
RFU 增高，表明活性氧族（ROS）含量高
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二、直接法
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，稀释液（Reagent C）
放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx 微升染色液（Reagent B）到新的1.5 毫升离心管，加入xx 微升稀
释液（Reagent C），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。
1． 准备1 个细胞培养24 孔板的待测细胞，细胞铺满率达70％
（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm 培养皿，和其它培养孔板，见注意事项4）
2． 小心抽去细胞培养液
3． 小心沿着孔壁加入xx 微升含有染色液（Reagent B）和稀释液（Reagent C）的染色工作液到1 个细胞
培养孔，覆盖培养孔表面
4． 放进37℃细胞培养箱里孵育20 分钟
5． 小心抽去含有染色工作液的细胞培养液
6． 小心沿着孔壁加入xx 微升37℃预热的保存液（Reagent D）到细胞培养孔
7． 选择下列方式之一进行操作：
注意事项
1． 本产品为20 次操作
2． 操作时，须戴手套
3． 孵育时，必须避免光照
4． 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm 培养皿，和各种培养孔板，须相应
调整操作用量：
操作容器操作用量
载玻片100 微升
载玻片培养皿1 毫升
35mm 培养皿1 毫升
96 孔培养板100 微升
48 孔培养板200 微升
24 孔培养板500 微升
12 孔培养板1 毫升
6 孔培养板2 毫升
25cm2 细胞培养瓶3 毫升
5． 根据细胞类型，调整染色工作液使用剂量（1：200 至1：1000 容量比），避免过度染色
6． 建议细胞染色完成后，即刻进行细胞荧光分析
7． 本公司提供阳性对照甲萘醌溶液（HL12041），观察细胞荧光增强现象
8． 本公司同时提供细胞内活性氧初级荧光测定试剂盒（HL10016.2），满足不同用户需求
9． 本公司提供系列活性氧分析试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定荧光清晰