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保存方式

保存染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；固着液（Reagent B）和离析液（Reagent C）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于细胞脱离

*细胞培养液：用于细胞操作所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器

1.5毫升离心管：用于染色液配制的容器

载玻片：用于组织染色操作

解剖针：用于植物组织解剖

血细胞计数仪：用于细胞计数

（微型）台式离心机：用于样品处理

培养箱：用于染色孵育

比色皿或酶标板：用于荧光定量分析的容器

（共聚焦）荧光显微镜：用于荧光分析

细胞流式仪：用于用于细胞染色分析

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析

实验步骤

方法一：活体组织染色

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在载玻片上
• 切取新鲜植物根尖，放进载玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖针小心压碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放进37℃培养箱里孵育20分钟
• 取出载玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 盖上盖玻片，用拇指小心且垂直加压
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

方法二：组织固定染色

• 加上xx微升清理液（Reagent A）在载玻片上
• 切取新鲜植物根尖，放进载玻片上的清理液（Reagent A）中
• 用解剖针小心压碎根尖
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升固着液（Reagent B）
• 室温下，孵育3小时，避免干化
• 小心移去固着液（Reagent B）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上xx毫升离析液（Reagent C）
• 室温下孵育5分钟
• 小心移去离析液（Reagent C）
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）

• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上xx微升染色液（Reagent D） 
• 放进37℃培养箱里孵育20分钟
• 取出载玻片，移去染色液
• 小心加上xx毫升清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 盖上盖玻片，用拇指小心且垂直加压
• 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长540nm，散发波长590nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

方法三、培养植物细胞脱离染色

• 准备1瓶25cm2细胞培养瓶的待测细胞
• 小心抽去细胞培养液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
• 置入37℃培养箱1分种
• 振动培养瓶，使细胞脱落
• 加入4毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）
• 移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数
• 移出1 X 106细胞到新的15毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升清理液（Reagent A）
• 再加入xx微升染色液（Reagent D），混匀
• 放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照
• 放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的xx微升清理液（Reagent A），轻柔混匀细胞颗粒群
• 放进冰槽里
• 选择下列方式之一进行操作：
  • 即刻进行细胞流式仪分析：藻红蛋白（phycoerythrin；PE）波段，观察50000个细胞以上――

波峰右移，表明超氧阴离子含量高

• 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片

2）激发波长540nm，散发波长590nm――

红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

• 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

1）移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色皿

2）加入xx微升清理液（Reagent A）

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪：激发波长540nm，散发波长590nm――

RFU增高，表明超氧阴离子含量高