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主要用途

纯化线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂是一种旨在通过钙黄绿素载入后离心处理或钴淬灭技术，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，而存在于或由线粒体释放到线粒体外的荧光染料，即刻发生荧光去除或淬灭，来分析和观察线粒体膜通道孔活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种纯化线粒体膜通道孔活性（瞬时或长期开放状态）的检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定。

技术背景

线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由线粒体内外膜成分构成的非特异性且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时，线粒体内容物通过膜通道孔释放到胞浆中。膜通道孔的开放，显著改变线粒体的通透性。钙离子过度进入、线粒体谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放，而造成细胞色素C的释放和线粒体膜电位的消失。钙黄绿素-AM，又称双甲亚胺二乙酸钠荧光素－乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作为荧光探针：*，适宜的分子量622kd，小于1.5kd；第二，几乎不具有膜结合性；第三，不是线粒体酶的底物；第四，容易进入细胞及其线粒体。钙黄绿素-AM进入线粒体后，被内酯酶切离，产生具有极性的荧光性强的钙黄绿素，被线粒体俘获。同时线粒体外的钙黄绿素通过离心去除或受到其淬灭剂钴离子的淬灭。一旦线粒体膜通道孔瞬时开放，钙黄绿素释放出线粒体外，由于离心处理或被钴离子淬灭。线粒体内钙黄绿素荧光的变化，表明膜通道孔的开放状态。

产品内容

染色液（Reagent A） 微升

中和液（Reagent B） 毫升

保存液（Reagent C） 毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

黑色96孔板：用于线粒体荧光分析的容器

1.5毫升离心管：用于线粒体染色的容器

载波片/盖玻片：用于线粒体样品存放后荧光分析

微型台式离心机：用于沉淀线粒体

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于线粒体荧光分析

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于线粒体荧光定量分析

实验步骤

• 直接法
• 准备好待测的纯化线粒体样品
• 移取100微升线粒体样品（总量为0.2毫克）到1.5毫升离心管
• 加入xx微升染色液（Reagent A），混匀
• 放进37℃细胞培养箱里孵育15分钟，避免光照
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升37℃预热的保存液（Reagent C），混匀颗粒群
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去保存液（Reagent C）
• 小心加入xx微升37℃预热的保存液（Reagent C），混匀颗粒群
• 选择下列方式之一进行操作：

（A）使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述悬液到载波片上，盖上盖玻片 

2）激发波长488nm，散发波长505nm――

绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

• 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

1）移取100微升上述悬液到100微升比色杯或黑色96孔板

2）即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪：激发波长488nm，散发波长505nm――

RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

• 间接法

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，中和液（Reagent B）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升染色液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升中和液（Reagent B），混匀后，标记为染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

• 准备好待测的纯化线粒体样品
• 移取100微升线粒体样品（总量为0.2毫克）到1.5毫升离心管
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升含有染色液（Reagent A）和中和液（Reagent B）的染色工作液，充分混匀 
• 放进37℃细胞培养箱里孵育15分钟，避免光照
• 选择下列方式之一进行操作：

• 使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片（每隔5分钟检测一次，持续30分钟）

2）激发波长488nm，散发波长505nm――绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

• 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

1） 移取100微升上述悬液到100微升比色杯或黑色96孔板

2） 即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪（每隔5分钟检测一次，持续30分钟）：激发波长488nm，散发波长505nm――RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
• 染色前，所有试剂溶液，除染色液（Reagent A）外，需37℃预热
• 建议染色完成后，即刻进行荧光检测分析 
• 孵育时，必须避免光照
• 本产品友好使用于双重染色或重叠染色
• 如果不具备505nm散发波长的滤波器，可以使用505nm至530nm中的任一波长
• 如果黑色96孔板的背景读数过高，可以选择530nm散发波长
• 如果膜通道孔为瞬时开放（transient），则荧光缓慢且自发降低
• 本公司提供膜通道孔抑制剂：D 0.2毫摩尔环胞素A（cyclosporine A）－12226，维护荧光完整
• 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰