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细胞色素 P450 亚酶 1A2 活性荧光定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

细胞色素 P450 亚酶 1A2 活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过甲氧基异酚噁唑脱甲基酶反应系统中甲氧基异酚噁唑转化为羟基异吩噁唑酮后荧光峰值的变化，即采用荧光法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品（动物、人体）或纯化微粒体样品细胞色素 P450 亚酶 1A2 的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

细胞色素P450亚酶1A2，简称为CYP1A2，是肝细胞微粒体复合功能氧化酶系统的成员之一，也是芳香族碳氢化合物加羟基酶（aryl hydrocarbon hydrorylase；AHH）的成员之一。在人体肝脏里占P450酶系15％。与

CYP1A1高度同源，特别是在外显子2、4、5和6。CYP1A2由多个多态性变体，常见的是：1A和1F，与kafeiyin代谢和迟发性皮肤卟啉症（porphyria cutanea tarda）相关。CYP1A2的作用在于体内外源化合物（xenobiotics），包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢，即单加氧化作用（monooxygenation）和羟化

作用（hydroxylation）,以及脂类合成包括胆固醇和类固醇。芳香族碳氢化合物诱导CYP1A2的表达。甲氧基异酚噁唑脱甲基酶（7－methoxyresorufin-O-demethylase；MROD）的活性是细胞色素P450亚酶1A2的诊断标记，其基于MROD选择性催化细胞色素P450亚酶1A2的活性。甲氧基异酚噁唑（7－methoxyresorufin）在甲氧基异酚噁唑脱甲基酶的催化下，转化为羟基异吩噁唑酮（resorufin）后荧光峰值的变化（激发波长530nm，

散发波长590nm），来定量测定细胞色素P450亚酶1A2的活性。甲氧基异酚噁唑脱甲基酶反应系统为：

产品内容

保存方式

保存在－20℃冰箱里，底物液（Reagent C）和 标准液（Reagent D）避免光照，有效保证 6 月

用户自备

1.5 毫升离心管：用于标准样品操作的容器

恒温水槽：用于孵育反应比色皿或酶标板：用于反应和比色的容器

荧光分光光度仪或酶标仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光分光光度仪（温度为 37℃）：激发波长 530nm，散发波长 590nm，并置零

3． 准备好 5 个 1.5 毫升离心管，标记为 1 至 5 号管4． 加入 xx 微升 缓冲液（Reagent A）到 1 号管5． 分别加入 xx 微升 缓冲液（Reagent A）到 2 至 5 号管

6． 移取 xx 微升 标准液（Reagent D）到 1 号管，混匀

7． 小心移取 xx 微升 1 号管稀释的 标准液（Reagent D）到 2 号管，混匀8． 小心移取 xx 微升 2 号管稀释的 标准液（Reagent D）到 3 号管，混匀9． 小心移取 xx 微升 3 号管稀释的 标准液（Reagent D）到 4 号管，混匀10．将 1 至 5 号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

二、 标准曲线测定

1． 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 反应液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升 底物液（Reagent C）

4． 加入 xx 微升上述配制的标准液

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在 37℃温度下孵育 10 分钟

7． 即刻放进荧光分光光度仪检测获得相对荧光读数

8． 重复实验步骤 1 至 7 四次

9． 构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为相对荧光单位；横座标（X 轴）为标准羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）

三、 样品测定

1． 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入 xx 微升 反应液（Reagent B）

3． 加入 xx 微升 底物液（Reagent C）

4． 加入 xx 微升待测样品（20 微克微粒体蛋白或 100 微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）

5． 上下倾倒数次，混匀

6． 在 37℃温度下孵育 10 分钟

7． 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相关荧光读数

8． （选择步骤）重复实验步骤 1 至 7，测读新的样品

9． 根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度

四、 计算样品活性

[根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）X 样品稀释倍数]÷ 10（分钟）]＝皮摩尔/

毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝皮摩尔/毫克/分钟

五、 酶标板测定

1． 在 96 孔酶标板上做好相应标记：标准样品和待测样品2． 分别移取 xx 微升 缓冲液（Reagent A）到相应孔中

3． 分别加入 xx 微升 反应液（Reagent B）

4． 分别加入 xx 微升 底物液（Reagent C）

5． 分别加入 xx 微升上述配制的标准液或待测样品（20 微克微粒体蛋白或 100 微克细胞裂解萃取液蛋白）

（注意：样品须清澈）6． 轻轻摇动 96 孔酶标板7． 在 37℃温度下孵育 10 分钟

8． 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数

9． 构建标准曲线：纵座标（Y 轴）为相对荧光单位；横座标（X 轴）为标准羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩

尔/升）

10．根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度

11．活性计算：

[根据标准曲线获得样品对应羟基异吩噁唑酮浓度（纳摩尔/升）X 样品稀释倍数]÷ xx（反应时间；分钟）]

＝皮摩尔/毫升/分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝皮摩尔/毫克/分钟

注意事项

1． 本产品为 25 次（比色皿）或 85 次（酶标板）操作，包括标准液

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准液测定只需 1 次

4． 样品须澄清，至关重要（本公司提供细胞可溶性总蛋白质制备试剂盒 30002.1）

5． 孵育反应完成后即刻进行荧光测定

6． 如果酶活性过低，可以增加反应时间至 30 分钟

7． 荧光测定后，比色皿须清洗*

8． 建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为 20 微克/100 微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为

100 至 200 微克/100 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 30030.1）

9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

10.通常人体细胞微粒体细胞色素 P450 亚酶 1A2 活性浓度为：200－600 皮摩尔/分钟/毫克蛋白

11．细胞色素 P450 亚酶 CYP1A2 单位活性定义为：在 37℃，pH 7.5 条件下，每分钟内能够转化 1 纳摩尔

甲氧基异酚噁唑至羟基异吩噁唑酮所需的酶量作为一个活性单位

12．本公司提供系列毒理学检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感